劉向云，王 永，李 雷，許 麗，蘇 欣，桂 博，周 莉，孫祖越

(上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理學(xué)檢測中心，上海 200032)

燈盞花素是從燈盞細(xì)辛中提取的活性成分，主要活性單體為燈盞乙素，具有擴(kuò)張微細(xì)血管和降低血液黏稠度的作用;能降低腦血管阻力、增加腦血流量和改善微循環(huán)，可用于腦血管病的治療［1］。為確定增加燈盞花素用藥劑量的安全性，從毒性病理學(xué)方面，觀察其毒性作用靶器官并探討不同種屬動物對同一藥物毒性反應(yīng)的差異，本研究采用了SD大鼠和比格犬分別給予燈盞花素后進(jìn)行體內(nèi)毒性比較研究，為臨床用藥提供比較毒性病理實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

注射用燈盞花素，批號:20100127，為淡黃色至黃色的疏松塊狀物，由昆明龍津藥業(yè)股份有限公司提供。含量按平均裝量計(jì)算，為標(biāo)示量的98.74%，用氯化鈉注射液配制。蘇木素、伊紅(HE)染料，10%甲醛固定液，購自德國Leica公司。RM2126石蠟切片機(jī)，為德國Leica公司產(chǎn)品;Nikon-50i顯微鏡，上海衡浩儀器有限公司等。

1.2 動物

SD大鼠，120只、雌雄各半、5～6周齡、體質(zhì)量100～140 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物合格證號:動物生產(chǎn)許可證SCXK(滬)2008-0016;動物使用許可證號:SYXK(滬)2008-0027;在上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所(中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心)SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于400 mm×350 mm×200 mm塑料籠內(nèi)，每籠飼養(yǎng)同性大鼠5只，自由飲水、攝食。室溫20～26℃，相對濕度40% ～70%，光照12 h，黑暗12 h。

比格犬，24只、雌雄各半、6～12個月齡、體質(zhì)量7.0～10.0 kg。由上海新岡實(shí)驗(yàn)動物場提供，動物合格證號:SCXK(滬)2007-0009;動物使用許可證號:SYXK(滬)2008-0027;動物飼養(yǎng)在上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所(中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心)大動物(犬、猴)實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)于不銹鋼籠內(nèi)，每籠1只;每天每只動物喂犬專用飼料250 g左右。上、下午各喂食1次，自由飲水;室溫18～28℃，相對濕度40% ～70%，空調(diào)通風(fēng)，光照明暗各12 h。

1.3 SD大鼠分組給藥

實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。經(jīng)一般行為觀察，選用符合要求大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為4組，每組30只，雌雄各半，分別為注射用燈盞花素30，60和120 mg·kg－1組及溶媒對照組，為臨床使用劑量的37.5，75和150倍。大鼠按照5 ml·kg－1，尾iv給予注射用燈盞花素30，60和120 mg·kg－1，每天1 次、共3 個月，恢復(fù)期(停止給藥)觀察1個月。分別于最后1次給藥24 h后(每組20只大鼠)和停藥1個月后(剩余大鼠)麻醉、解剖。

1.4 比格犬分組給藥

比格犬實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)14 d，用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。經(jīng)一般行為觀察，選用符合要求比格犬進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。24只，雌雄各半，分別按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組6只動物，分別為注射用燈盞花素25，50和100 mg·kg－1組和溶媒對照組，分別為臨床使用劑量的30，60和120倍。按照2 ml·kg－1比格犬iv給予燈盞花素25，50和100 mg·kg－1，每天1 次，共3個月，恢復(fù)期(停止給藥)觀察1個月。分別于最后1次給藥24 h后(每組4只犬)和停藥1個月后(剩余犬)麻醉、解剖。

1.5 HE染色和病理學(xué)觀察

大鼠或比格犬iv給予3%戊巴比妥鈉約1.0 ml·kg－1iv 麻醉，放血處死后解剖取材［2］。詳細(xì)觀察大腦、小腦、骨髓、甲狀腺、唾液腺、腎上腺、胰腺、氣管、心、肺、睪丸、附睪、子宮、卵巢、脾和淋巴結(jié)情況并記錄所有陽性病變，組織取材固定于10%甲醛固定液中，包埋、切片及HE染色。所有組織脫水后常規(guī)包埋，修塊切片，每張切片厚度約3 μm，烘干后用自動染色機(jī)進(jìn)行HE染色、封邊。在光學(xué)顯微鏡下對大鼠和比格犬組織進(jìn)行觀察、比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 注射用燈盞花素對SD大鼠和比格犬神經(jīng)系統(tǒng)病理的影響

如圖1所示，大鼠和犬中鏡下觀察均顯示神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)組織無明顯異常改變(圖1)。大鼠燈盞花素30，60和 120 mg·kg－1以及比格犬 25，50 和100 mg·kg－1組給藥期及恢復(fù)期大腦脂質(zhì)體均軟腦膜完整，皮質(zhì)和髓質(zhì)未見明顯病變(圖1A和E);小腦皮質(zhì)分子層、浦肯野層和顆粒層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，均未見明顯病變(圖1B和F);脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)分界清楚，角細(xì)胞內(nèi)可見粗大的尼氏體，均未見明顯異常(圖1C和G)。垂體前、中和后葉結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病變(圖1D和H)。

Fig.1 Effect of breviscapine on pathology of nervous system in rats and dogs(HE ×100).Rats were iv injected breviscapine 30，60 and 120 mg·kg －1，once daily，for 3 months.Dogs were iv given breviscapine 25，50 and 100 mg·kg－1，once daily，for 3 month，and recovered for 1 month.A，B，C and D:cerebrum，cerebellum，spinal cord and hypophysis in rats in breviscapine 120 mg·kg－1group，respectively.E，F(xiàn)，G and H:cerebrum，cerebellum，spinal cord and hypophysis in dogs in breviscapine 100 mg·kg－1group，respectively.

2.2 注射用燈盞花素對SD大鼠和比格犬內(nèi)分泌系統(tǒng)病理的影響

由圖2大鼠和犬中鏡下觀察結(jié)果可見，內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)臟器無明顯異常改變。大鼠燈盞花素30，60和120 mg·kg－1以及比格犬25，50 和100 mg·kg－1組給藥期及恢復(fù)期甲狀腺均未見明顯病變，濾泡結(jié)構(gòu)清晰，腔內(nèi)充滿膠體(圖2A和E);甲狀旁腺均未見明顯病變(圖2B和F);唾液腺均未見明顯病變，腺體以小期葉狀分布，結(jié)構(gòu)清晰(圖2C和G);各劑量組給藥期及恢復(fù)期腎上腺皮質(zhì)三帶結(jié)構(gòu)清楚，髓質(zhì)細(xì)胞正常，未見明顯病變;胰腺結(jié)構(gòu)完整、清晰，外分泌部的導(dǎo)管及腺泡未見病變，腺泡內(nèi)可見胰島分布，均未見明顯病變(圖2D和H)。

Fig.2 Effect of breviscapine on pathology in endocrine system in rats and dogs(HE ×100).See Fig.1 for rat and dog treatment.A，B，C and D:normal thyroid，parathyroid，sialaden and adrenal gland in rats in breviscapine 120 mg·kg－1group，respectively.E，F(xiàn)，G and H:normal thyroid，parathyroid，sialaden and adrenal gland in dogs in breviscapine 100 mg·kg－1group，respectively.

2.3 注射用燈盞花素對SD大鼠和比格犬消化系統(tǒng)病理的影響

大鼠的鏡下觀察結(jié)果，均顯示肝和胃結(jié)構(gòu)清晰，無明顯異常改變(圖3A和B)。犬的鏡下觀察結(jié)果，燈盞花素100 mg·kg－1組1只雌性犬胃黏膜細(xì)胞輕度水腫(圖3D)。其余各劑量組給藥期及恢復(fù)期胃黏膜被覆黏膜上皮，可見各種腺細(xì)胞，未見明顯病變。注射用燈盞花素100 mg·kg－1組給藥期1只雌性犬肝可見多處小肉芽腫性炎癥，匯管區(qū)輕度纖維化，注射用燈盞花素50 mg·kg－1組1只雌性犬可見多處小肉芽腫性炎癥(圖3F);燈盞花素100 mg·kg－1組 1 只雄性犬肝竇擴(kuò)張，中度淤血(圖3G);犬注射用燈盞花素25，50 和100 mg·kg－1組給藥期及恢復(fù)期肝小葉均結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心反射狀排列，未見明顯病變。

2.4 注射用燈盞花素對SD大鼠和比格犬的泌尿系統(tǒng)病理的影響

大鼠的鏡下觀察結(jié)果，均顯示膀胱和腎結(jié)構(gòu)清晰，無明顯異常改變(圖4A和B)。犬的鏡下觀察結(jié)果，注射用燈盞花素各劑量組膀胱在給藥期及恢復(fù)期均結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病變(圖4C);腎小管給藥期及恢復(fù)期均未見明顯病變(圖4D);給藥期注射用燈盞花素100 mg·kg－1組1只雄性犬腎近端腎小管細(xì)胞重度腫脹，管腔消失(圖4E);給藥期注射用燈盞花素100 mg·kg－1組1只雌性犬腎小管細(xì)胞均脫落至管腔(圖4F)。

Fig.3 Effect of breviscapine on pathology in digestive system in rats and dogs(HE ×100).See Fig.1 for rat and dog treatment.A and B:liver and stomach in rats in breviscapine 120 mg·kg－1group，respectively.C，D:liver and stamoch in dogs in breviscapine 100 mg·kg－1group.E:liver fibrosis in one dog in breviscapine 100 mg·kg－1group.F:granulomatous inflammation of liver in one dog in breviscapine 50 mg·kg－1group.G，H:congestion of liver and gastric mucosa edema in one dog in breviscapine 100 mg·kg－1group，respectively.

Fig.4 Effect of breviscapine on pathology of endocrine system in rats and dogs(HE ×100).See Fig.1 for rat and dog treatment.A and B:bladder and kidney in rats in breviscapine 120 mg·kg －1group，respectively.C and D:bladder，kidney in one dog in breviscapine 100 mg·kg －1group;E and F:kidney tubules edema and malpighian tube skin cells falling off in one dog in breviscapine 100 mg·kg －1，respectively.

2.5 注射用燈盞花素對SD大鼠和比格犬的心臟和呼吸系統(tǒng)病理的影響

大鼠的鏡下觀察結(jié)果顯示，注射用燈盞花素30，60 和120 mg·kg－1組均顯示氣管、肺和心結(jié)構(gòu)清晰，無明顯異常改變(圖5A，B和C)。犬的鏡下觀察結(jié)果顯示，犬注射用燈盞花素 25，50和100 mg·kg－1組給藥期及恢復(fù)期氣管均未見明顯病變(圖5D)。注射用燈盞花素100 mg·kg－1組1只雄性犬肺泡腔消失，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺實(shí)變(圖5E);注射用燈盞花素25，50和100 mg·kg－1組1只雌性犬肺泡腔萎陷，腔內(nèi)充滿脫離上皮細(xì)胞(圖5H)，其余各劑量組給藥期及恢復(fù)期均未見明顯病變;各劑量組給藥期及恢復(fù)期心肌纖維、心內(nèi)膜和心外膜均未見明顯病變(圖5F和G)。

Fig.5 Effect of breviscapineon toxicity pathology of breath and cardiovascular systemsin ratsand dogs(HE ×100).See Fig.1 for rat and dog treatment.A，B and C:trachea，lungs，and heart in rats in breviscapine 120 mg·kg－1group，respectively.D，E and F:trachea，lung and heart in dogs in breviscapine 100 mg·kg －1group.G and H:pneumonia and collapsed pulmonary alveoli in breviscapine 100 mg·kg－1group，respectively.

2.6 注射用燈盞花素對SD大鼠和比格犬的生殖系統(tǒng)病理的影響

大鼠和犬中鏡下觀察結(jié)果均顯示，生殖系統(tǒng)相關(guān)臟器無明顯異常改變(圖6)。大鼠注射用燈盞花素30，60和120 mg·kg－1組及犬注射用燈盞花素25，50 和100 mg·kg－1組給藥期及恢復(fù)期睪丸、附睪(雄性)(圖 6A，B，E和 F)、子宮和卵巢(雌性)(圖6C，D，G和H)結(jié)構(gòu)清晰，均未見明顯病變。

2.7 注射用燈盞花素對SD大鼠和比格犬的免疫系統(tǒng)病理的影響

如圖7所示，大鼠的鏡下觀察結(jié)果顯示，免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)清晰，無明顯異常改變(圖7A和B)。犬的鏡下觀察結(jié)果，給藥期注射用燈盞花素100 mg·kg－1組 1只雌性犬和注射用燈盞花素25 mg·kg－1組1只雄性犬脾重度淤血，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)不清(圖7E和F);注射用燈盞花素100 mg·kg－1組1只雌性犬腸系膜淋巴結(jié)皮、髓質(zhì)分界不清、血管擴(kuò)張、淤血;注射用燈盞花素100 mg·kg－1組1只雄性犬給藥局部淋巴結(jié)內(nèi)可見少量棕黃色顆粒沉淀(圖7G和H);其余注射用燈盞花素各劑量組給藥期及恢復(fù)期未見明顯病變(圖7C和D)。

Fig.6 Effect of breviscapine on pathology of reproductive system in rats and dogs(HE ×100).A，B，C and D:testicle，epididymis，ovary and uterus in rats groups，respectively.E，F(xiàn)，G and H:testicles，epididymes，ovary and uterus in dogs in breviscapine 100 mg·kg －1groups，respectively.

Fig.7 Effect of breviscapine on pathology of immune system in rats and dogs(HE ×100).A and B:normal lymphonodes and spleen in rats in breviscapine 120 mg·kg －1;C and D:normal lymphnodes and spleen in dogs in breviscapine 100 mg·kg －1groups，respectively.E and F:spleen congestion in one dog in breviscapine 100 mg·kg －1and 25 mg·kg －1groups，respectively;G and H:a small amount of tan in lymphnodes precipitation in one dog in breviscapine 100 mg·kg －1and 25 mg·kg －1groups，respectively.

3 討論

肝、腎、脾和肺是藥物毒性作用最常見的靶器官［3］，目前這些重要臟器毒性作用的判斷主要依靠血生化、血液學(xué)、尿及病理形態(tài)觀察，當(dāng)尿及血液學(xué)未出現(xiàn)改變，或尿及血液學(xué)檢測不準(zhǔn)確，或不能反映重要臟器損傷時，則必須依靠病理檢查。不同種屬動物，其臟器結(jié)構(gòu)存在一定的差異性，在藥物毒性的反應(yīng)上也不盡相同。本研究中注射用燈盞花素對SD大鼠給藥期和停藥恢復(fù)期各劑量組未見明顯器官毒性，而對比格犬出現(xiàn)了肝、胃、腎、肺、脾和淋巴結(jié)等不同程度的損害，其中脾和淋巴結(jié)淤血可能是由于動物麻醉處死時放血不徹底造成的。臟器的異常改變說明不同動物對注射用燈盞花素素的耐受性、敏感性和毒性反應(yīng)存在種屬差異［4］，停藥1個月后基本可以恢復(fù)正常。徐勤等［5－7］研究發(fā)現(xiàn)，比格犬和SD大鼠肝、脾和腎存在結(jié)構(gòu)上的差異。比格犬肝小葉中央靜脈間距大于SD大鼠肝小葉中央靜脈間距;比格犬中央靜脈和匯管區(qū)間距同樣大于SD大鼠的中央靜脈-匯管區(qū)間距［5］。比格犬近髓腎單位大于皮質(zhì)腎單位，而SD大鼠近髓腎單位及皮質(zhì)腎單位大小無顯著性差異。比格犬腎小球較SD大鼠腎小球稍大［6］。比格犬脾小結(jié)中央動脈周圍淋巴鞘及脾小體帽區(qū)厚度均大于SD大鼠，但性別對犬及大鼠各組織形態(tài)參數(shù)無影響［7］。這些臟器結(jié)構(gòu)的不同可能是造成藥物對實(shí)驗(yàn)動物種屬差異的原因之一。

肝和腎對藥物代謝起著重要作用，盡管有很多體外替代實(shí)驗(yàn)，但是并不能完全替代藥物在機(jī)體中的代謝過程。Grime等［8］對22種藥進(jìn)行了大鼠、犬和人體內(nèi)代謝過程的比較研究，發(fā)現(xiàn)肝對藥物的代謝率存在明顯的種屬差異。同樣，由于不同的血漿蛋白結(jié)合率和腎血流量，藥物在犬的腎清除率也有著明顯差異［9］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，淋巴液的轉(zhuǎn)運(yùn)盡管在不同種屬的動物體內(nèi)過程較為相似，但是對某些需要淋巴液轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物，小動物的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低［10］。由于不同種屬動物體內(nèi)的臟器結(jié)構(gòu)、代謝率和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)效率的差異，某些藥物在不同種屬動物體內(nèi)會出現(xiàn)不同的毒性病理結(jié)果。注射用燈盞花素在大鼠的長期毒性實(shí)驗(yàn)中沒有明顯的臟器毒性，但在犬的長期毒性實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了個別動物個別臟器的毒性，說明注射用燈盞花素對臟器毒性反應(yīng)存在種屬差異，具體毒性機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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