彭沙莎 ，任佐華 ，黃小莉 ，劉敏捷 ，孫良菲 ，劉二明

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科技學(xué)院，長沙，410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

十字花科作物根腫病是一種全球性的土傳病害，由蕓薹根腫病菌 （Plasmodiophora brassicaeWoron）侵染引起，該病在中國大部分省、市、自治區(qū)均有分布[1，2]。在利于病害發(fā)生的環(huán)境下，根腫病可導(dǎo)致十字花科作物嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收，且發(fā)病后的土壤將長期帶菌，不再適宜栽培十字花科作物[3～5]。1984年，湖南地區(qū)首次報道有根腫病害發(fā)生[6]，僅長沙地區(qū)發(fā)病面積達(dá)到66.7 hm2。

目前，培育和種植抗根腫病品種被認(rèn)為是防治根腫病最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的措施[7，8]。但是，蕓薹根腫病菌是一種不可人工培養(yǎng)的專性寄生菌，不同地區(qū)和不同品種中均存在著病菌生理小種分化現(xiàn)象[8，9]。

國際上通用的根腫病生理小種鑒別系統(tǒng)有兩個，分別是Williams鑒別系統(tǒng)[10]和歐洲根腫病菌鑒別寄主（ECD）系統(tǒng)[11]。鑒于ECD系統(tǒng)共有15個鑒別品種，鑒定時需要栽培大量植株，且當(dāng)鑒定菌株數(shù)量較多時，對鑒定場地的需求大，工作量也大，鑒定條件不易保持一致[12]，而Williams鑒別系統(tǒng)因具有鑒別寄主少、使用方便、容易理解[13]等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。本研究采用Williams鑒別系統(tǒng)首次對湖南4個地區(qū)十字花科作物根腫病主要發(fā)病區(qū)域的病菌進(jìn)行生理小種鑒定，旨在為今后湖南省十字花科作物抗病育種、抗源篩選及抗性品種布局提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病株采自湖南省懷化、益陽、株洲和長沙4個地區(qū)十字花科作物大白菜、紅菜薹、榨菜和油菜種植病區(qū)（表1）。將洗凈后的單株裝入密封袋，編號，置于-20℃冰箱中保存。

Williams根腫病菌鑒別系統(tǒng)的4個鑒別寄主，即 2 個結(jié)球甘藍(lán)品種 Jersey Queen（J.Q.）、Badger Shipper（B.S.），2 個蕪菁甘藍(lán)品種 Laurentian（L.T.）、Wilhelmsburger（W.B.），均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)十字花科作物根腫病生理小種鑒定品種育種室提供。感病品種為四季奶油小白菜，購于長沙馬王堆蔬菜批發(fā)市場。育苗基質(zhì)為播種專用營養(yǎng)土，由盛泰（香港）園藝科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

①接種菌液的制備 取保存于-20℃冰箱中的單株根瘤30 g勻漿，配制成200 mL菌液。利用Neubauer血球計數(shù)板計數(shù)，將菌液中的孢子濃度調(diào)至24×107個/g，將菌液加入到600 g已滅菌2 h的育苗基質(zhì)中，攪拌均勻，菌土的含水量以手握成團(tuán)、觸之即散為宜，24℃避光密封發(fā)酵48 h以上，其菌土中病菌休眠孢子濃度為 4×107個/g[14，15]。

②接種方法 將已滅菌2 h的育苗基質(zhì)裝入營養(yǎng)缽（規(guī)格為8 cm×8 cm），澆足底水使基質(zhì)濕潤，營養(yǎng)缽中心用實心棒插一深3 cm、直徑2 cm的圓穴，置入已制備好的病菌土。每份病菌土分裝100缽（4個鑒別寄主和1個感病品種各20缽），每缽播4粒種子，且直接播在置入的病菌土之上，每份菌土保苗40株以上[16～19]。在播完種之后，必須使用不同的托盤擺放，避免交叉感染[20]。播種后苗床的溫度控制在25℃，土壤濕度保持在90%，pH值控制在6～7[19，21]，為根腫病菌的發(fā)病營造良好條件。

③病情調(diào)查 出苗后45～60 d（大約8片真葉）進(jìn)行病情調(diào)查與統(tǒng)計，病情分級標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項“十字花科作物根腫病防控技術(shù)研究與示范”項目組制定。

0級：根部無腫瘤；1級：側(cè)根有小腫瘤；3級：主根腫大，其直徑小于2倍莖基部；5級：主根腫大，其直徑是莖基部的2～3倍；7級：主根腫大，其直徑是莖基部的3～4倍；9級：主根腫大，其直徑是莖基部的4倍以上或腫大的根部變黑。

計算公式： 發(fā)病率（%）=（病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)）×100%；病情指數(shù)=[∑（各級發(fā)病株數(shù)×級數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病情級數(shù)）]×100；病情指數(shù)＜10為抗病，病情指數(shù)≥10為感病[22]。

表1 供試病樣來源

表2 Williams根腫病菌生理小種鑒別系統(tǒng)

④生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn) 依照病菌在4個鑒別寄主上的致病反應(yīng)型，具體見表2，按Williams根腫病菌生理小種鑒別系統(tǒng)劃分生理小種[10]。

2 結(jié)果與分析

來自湘西南懷化、湘北益陽、湘中株洲和長沙4個地區(qū)的十字花科作物大白菜、榨菜、紅菜薹和油菜根腫病株共12份，由表3可知，依據(jù)Williams鑒別系統(tǒng)，鑒定出4個根腫病菌生理小種，即1、4、9和13號，它們在病樣中出現(xiàn)的頻率分別為16.7%、33.3%、16.7%和33.3%。

從寄主生理小種組成看，大白菜根腫病菌生理小種有1號、4號、9號和13號，榨菜根腫病菌生理小種為1號，紅菜薹根腫病菌生理小種有4號和9號，油菜根腫病菌生理小種有4號和13號；從地區(qū)生理小種分布來看，湘西南懷化大白菜根腫病菌為生理小種1號和13號、榨菜根腫病菌為生理小種1號，湘北益陽紅菜薹根腫病菌為生理小種4號，湘中株洲油菜根腫病菌為生理小種4號和13號，湘中長沙大白菜和紅菜薹根腫病菌生理小種均為9號。

3 小結(jié)與討論

本研究利用Williams鑒別系統(tǒng)對湖南4個地區(qū)十字花科作物大白菜、榨菜、紅菜薹和油菜共12份根腫病株進(jìn)行了鑒定，確定了 1、4、9、13號4個生理小種。鑒定結(jié)果顯示，同一地區(qū)的相同寄主病株根腫病菌生理小種存在不同，如湘中株洲的油菜病株，經(jīng)鑒定得到4號和13號2個生理小種；同一地區(qū)的不同寄主病株根腫病菌生理小種也存在不同，如湘西南懷化的大白菜根腫病菌為生理小種1號和13號、榨菜根腫病菌為生理小種1號，不同品種的寄主因根腫病菌存在致病性分化，其抗感反應(yīng)表現(xiàn)也不同。

表3 湖南十字花科作物根腫病菌生理小種鑒定

目前，國內(nèi)十字花科作物根腫病菌生理小種研究僅在大白菜根腫病菌中有報道。沈向群等[23]對采自遼寧、吉林、山東和四川等15個主要發(fā)病區(qū)域的大白菜根腫病菌進(jìn)行了鑒定，其中11個地區(qū)的根腫病菌的種群以4號生理小種為主，同時發(fā)現(xiàn)2、7、10、11號生理小種菌株各1個。本研究中湖南大白菜根腫病菌生理小種有1、4、9和13號，不同地區(qū)的大白菜根腫病菌生理小種不同。

本研究初步確定了湖南4個地區(qū)十字花科作物大白菜、紅菜薹、榨菜和油菜的根腫病菌的生理小種組成，但要明確湖南省十字花科作物根腫病菌的生理小種組成，需要更廣泛地調(diào)查和取樣，進(jìn)一步開展生理小種的鑒定工作。

[1]黃云.植物病害生物防治學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

[2]孫保亞，沈向群，郭海峰，等.十字花科植物根腫病及抗病育種研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，2005（4）：34-37.

[3]Howard R J,Strelkov S E,Harding M W.Clubroot of cruciferous crops-new perspectives on an old disease[J].Canadian Journal of Plant Pathology,2010,32(1):43-57.

[4]王靖，黃云，胡曉玲，等.油菜根腫病癥狀、病原形態(tài)及產(chǎn)量損失研究[J].中國油料作物學(xué)報，2008，30（1）：112-115.

[5]Hwang S F,Strelkov S E,Feng J,et al.Plasmodiophora brassicae:a review of an emerging pathogen of the Canadian canola(Brassica napus)crop[J].Molecular Plant Pathology,2012,13(2):105-113.

[6]楊宇紅，張雄飛，鄒立君.長沙地區(qū)大白菜根腫病發(fā)生規(guī)律研究[J].湖南農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1992（18）：854-858.

[7]Manzanares-Dauleux M J,Divaret I,Baron F,et al.Evaluation of FrenchBrassica oleracealandraces for resistance toPlasmodiophora brassicae[J].Euphytica,2000,113:211-218.

[8]Diederichsen E,Frauen M,Linders E G A,et al.Status perspectives of glubroot resistance breeding in crucifer crops[J].Plant Growth Regul,2009,28:265-281.

[9]Honig F.Der Koblkopferreger (Plasmodiophora brassicaeWor.)[M].Eine Monographie.Gartenhauwissen-achaft,1931:116-225.

[10]Williams P H.A system for the determination of races ofPlasmodiophorae brassicaethat infect cabbage and rutabga[J].Phytopathology,1966,56:624-626.

[11]Buczack S T,Toxopeus H,Mattusch P,et al.Study of physiologic specialization inPlasmodiophora brassicae:proposals for attempted rationalization through an international approach [J].Transactions of the British Mycological Society,1975,65:295-303.

[12]劉勇，羅一帆，黃小琴，等.蕓薹根腫病菌生理小種鑒別方法研究進(jìn)展[J].中國油料作物學(xué)報，2011，33（4）：420-426.

[13]Johnston T D.Clubroot inBrassica:a standard inoculation technique and the specification ofraces [J].Plant Pathology,1968,17:184-187.

[14]楊永林.十字花科蔬菜根腫病抑菌型土壤初探[J].植物保護(hù)學(xué)報，1990，17（2）：127-131.

[15]郭向華.甘藍(lán)根腫病菌的生物學(xué)特性及致病研究[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

[16]司軍，李成瓊，肖崇剛，等.甘藍(lán)根腫病接種方法的研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2003（3）：216-219.

[17]丁云花，簡云才.十字花科蔬菜根腫病菌生理小種及接種方法[J].中國蔬菜，2005（8）：29-31.

[18]李妍，謝學(xué)文，向文勝，等.白菜根腫病的接種方法[J].植物保護(hù)學(xué)報，2011，38（1）：95-96.

[19]李曉鷗，吳飛燕，鐘惠宏，等.大白菜根腫病苗期人工接種抗病性鑒定技術(shù)初報[J].中國蔬菜，1990（6）：6-9.

[20]李金萍，朱玉芹，李寶聚.十字花科蔬菜根腫病的傳播途徑[J].中國蔬菜，2010（5）：21-22.

[21]謝文瑞，黃一修.臺灣十字花科蔬菜根瘤病菌的病原性生理分化[J].植物保護(hù)學(xué)會會刊（臺灣地區(qū)），1988，30（4）：393-398.

[22]Strandberg J O,Williams P H.Inheritance of clubroot resistance in Chinese cabbage[J].Phytopathology,1967,57:330.

[23]沈向群，聶凱，吳瓊，等.大白菜根腫病主要生理小種種群分化鑒定初報[J].中國蔬菜，2009（8）：59-62.