反相高效液相色譜法測定痛寧膠囊中延胡索乙素的含量

王俊杰(解放軍第152中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南平頂山 467000)

痛寧膠囊是由醋延胡索、徐長卿、白芷、川芎、郁金、香附、防風(fēng)、葛根8味中藥組成的復(fù)方制劑［批準(zhǔn)文號:濟制字(2011)B11007］，具有理氣、活血、祛風(fēng)、止痛之功效。常用于氣滯血瘀的胃痛、頭痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、腰痛等疾病，在我院多年臨床療效確切。為更好有效控制制劑質(zhì)量，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-6］，選擇方中君藥醋延胡索中有效成分延胡索乙素為質(zhì)控指標(biāo)，采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定制劑中該成分含量，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT HPLC儀(日本島津公司生產(chǎn));SPD-M20A二極管陣列檢測器;LC solution色譜工作站。

1.2 藥品與試劑

延胡索乙素對照品(購自中國食品藥品檢定所研究院，批號:110726-200412);痛寧膠囊(自制，批號:130403、130502、130701)。乙腈、甲醇為色譜級，水為純化水，其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:WondasilTMC18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.1 mol/L乙酸銨溶液(39∶61);流速:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:280 nm;進(jìn)樣量:10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液:精密稱取延胡索乙素對照品10.39 mg置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為103.9 μg/ml的延胡索乙素對照品儲備液。精密量取上述儲備液2 ml置于5 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得41.56 μg/ml的延胡索乙素對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液:取痛寧膠囊粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率120 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，用60%乙醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 ml，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移并定容置于5 ml量瓶，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性溶液:按處方比例稱取缺醋延胡索其他藥材，按制備工藝制備缺醋延胡索的陰性樣品，依“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl，按上述色譜條件HPLC法測定，記錄色譜圖，供試品溶液與對照品溶液在相同保留時間點延胡索乙素分離度良好，陰性無干擾，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取延胡索乙素對照品儲備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 ml分別置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，再分別精密吸取該對照品溶液各10 μl，按2.1色譜條件進(jìn)樣，測定延胡索乙素峰面積。以延胡索乙素進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，最小二乘法進(jìn)行線性回歸擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1.25×106X －3.26×104，r=0.9999，表明其進(jìn)樣量在0.042～0.374 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取痛寧膠囊供試品溶液，精密吸取10 μl，注入HPLC儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定延胡索乙素峰面積，積分值 RSD為0.67%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一痛寧膠囊供試品溶液，分別放置0、2、6、12、24 h后精密吸取10 μl注入HPLC儀，按上述色譜條件測定延胡索乙素峰面積，積分值RSD為1.26%，表明延胡索乙素溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批號的痛寧膠囊6份，每份約1.0 g，依“2.2.2”項下制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，延胡索乙素峰面積積分值RSD為1.27%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知延胡索乙素含量的痛寧膠囊樣品(延胡索乙素含量為0.36 mg/g)9份，每份0.5 g，分別按延胡索乙素含量80%，100%，120%精密加入對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，依上述測定延胡索乙素的含量，計算平均加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件對品進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2。由結(jié)果得出結(jié)論，暫定制劑成品延胡索乙素含量不低于0.35 mg/g。

3 討論

3.1 樣品制備方法的選擇

延胡索乙素為叔胺類生物堿，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶劑。筆者試驗中分別選擇甲醇、甲醇-氨試液(20∶1)、60%乙醇作為提取溶劑，考察超聲與回流2種方法，實驗表明，60%乙醇為溶劑超聲30 min處理樣品，與其他提取溶劑及提取方法相比較，延胡索乙素含量較高，陰性無干擾，且雜質(zhì)峰較少，考慮實驗經(jīng)濟、環(huán)保性，本實驗選擇60%乙醇為溶劑，提取超聲30 min處理制備樣品。

表1 延胡索乙素加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery test of tetrahydropulmatine

表2 樣品含量測定結(jié)果Tab 2 Determination results of the content of samples

3.2 檢測波長的選擇

筆者通過對比二極管陣列檢測器對目標(biāo)成分響應(yīng)程度，參考UV掃描圖形，并對峰純度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示延胡索乙素在280 nm處響應(yīng)程度最高，峰純度指數(shù)最大，顯示無不純物檢出，確定280 nm為檢測波長。

3.3 色譜條件的選擇

筆者在實驗過程中曾考察以下流動相體系:甲醇-水-三乙胺(60∶40∶0.5)、甲醇-0.04%磷酸(三乙胺調(diào)pH值為3.5)、乙腈-1%磷酸(三乙胺調(diào)pH值為5.0)(23∶77)，乙腈-2%冰乙酸溶液(三乙胺調(diào)pH值為5.0)(25∶75)。在上述復(fù)雜流動相體系下，供試品中延胡索乙素目標(biāo)峰與其他峰未分開，陰性有干擾，且保留時間不合適。最終試驗在乙腈-0.1 mol/L乙酸銨溶液(39∶61)流動相條件下，指標(biāo)成分色譜峰峰形好，分離度好，保留時間適中(約17 min)，陰性無干擾，專屬性強，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

本方法快速、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可作為痛寧膠囊中指標(biāo)成分延胡索乙素含量的測定方法。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［S］.2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:130，526.

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