4種滋陰藥含藥血清的免疫調(diào)節(jié)作用的比較研究*

★賴小東 趙益 尚廣彬 徐國(guó)良 孫有智（江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

臨床上治療腫瘤的方法雖然各不相同，但滋陰清熱是其中最為常用的治療方法之一。滋陰藥可以提高機(jī)體的免疫功能來(lái)達(dá)到抗腫瘤的作用，例如六味地黃湯、山藥、墨旱蓮、枸杞子能提高免疫功能[1-6]。本實(shí)驗(yàn)選擇了4種常用的滋陰方：六味地黃丸、二至湯、二冬膏、一貫煎，考察他們對(duì)大鼠免疫功能的影響以及分泌IL-2的作用，比較其提高免疫的強(qiáng)弱，為研究抗腫瘤效應(yīng)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重180±20g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。批號(hào)：SCXK（贛）2005-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

天冬、麥冬、女貞子、墨旱蓮、北沙參、麥冬、當(dāng)歸、生地、枸杞子、川楝子，均購(gòu)于北京同仁堂藥店；六味地黃丸水蜜丸（北京同仁堂藥店，批號(hào)：1004701）。

二冬湯：精密稱取天冬200g、麥冬200g，第一次加入8倍量的水煎煮3小時(shí)，第二次加入6倍量的水煎煮2小時(shí)，合并濾液，過(guò)濾，濾液濃縮，密度為2g/mL。

六味地黃丸：稱取六味地黃丸300g，加雙蒸水研磨至密度為2g/mL。

二至湯：稱取女貞子200g、墨旱蓮200g，第一次加入8倍量的水煎煮3小時(shí)，第二次加入6倍量的水煎煮2小時(shí)，合并濾液，過(guò)濾，濾液濃縮，密度為2g/mL。

一貫煎：稱取北沙參161g，麥冬161g，當(dāng)歸161g，生地483g，枸杞子193.2g，川楝子80.5g。第一次加入8倍量的水煎煮3小時(shí)，第二次加入6倍量的水煎煮2小時(shí)，合并濾液，過(guò)濾，濾液濃縮，密度為2 g/m L。

1.3 主要試劑與儀器

刀豆蛋白A：Sigma公司（批號(hào)：20110918）；脂多糖：Sigma公司（批號(hào)：20110926）；大鼠白細(xì)胞介素IL-2試劑盒：上海西塘生物科技有限公司；

1.4 動(dòng)物分組與含藥血清制備

清潔級(jí)SD大鼠30只，普通環(huán)境，自然光照，自由飲水、普通飼料，室溫20±2℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)三天后，按體重隨機(jī)分為兩組：空白對(duì)照組、二冬湯組、六味地黃丸組、二至湯組、一貫煎組，每組6只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定給藥劑量為二冬湯7.99g/kg/天，六味地黃丸4.8g/kg/天，二至湯6.77g/kg/天，一貫煎15.4 g/kg/天，每天分2次以灌胃方式給藥，給藥5天后，取血，放在25℃室溫下靜置1小時(shí)，凝血后2 000rpm離心20分鐘，取上清液，并將同一組大鼠的血清合并，56℃滅活30分鐘，然后用0.22μm醋酸纖維素膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 大鼠脾淋巴細(xì)胞的制備

無(wú)菌條件下剖開(kāi)雄性SD大鼠腹腔取脾，用生理鹽水沖洗干凈，在100目篩網(wǎng)上一邊研磨一邊用Hank＇s液沖洗，收集分離所得的脾細(xì)胞懸液，1 000r/分離心5分鐘，吸棄上清；添加紅細(xì)胞裂解液10mL，混勻脾細(xì)胞，靜置4-5分鐘，待紅細(xì)胞完全破碎后，1 000r/分離心5分鐘，吸棄上清剔除紅細(xì)胞，Hank＇s液沖洗3遍，用RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/mL。

1.6 4種含藥血清對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的影響

在96孔培養(yǎng)板中分別加入含藥血清使終濃度為10%，20%，每個(gè)濃度組分別設(shè)相應(yīng)濃度的空白對(duì)照組血清最為對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)置一個(gè)不含血清組對(duì)照，每孔中加入1×108個(gè)/mL細(xì)胞懸液100μL，100μg/mL的ConA，使終濃度為10 μg/mL，將培養(yǎng)板置5%的CO2培養(yǎng)箱飽和濕度37℃培養(yǎng)72小時(shí)。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，加入5mg/mL的MTT溶液20μL，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。取出培養(yǎng)板，每孔加入200μL二甲基亞砜（DMSO），靜置20分鐘，使紫色結(jié)晶呈完全溶解。，以無(wú)細(xì)胞懸液孔調(diào)零，490nm處使用酶標(biāo)儀測(cè)OD值。

1.7 4種含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞活性檢測(cè)

在96孔培養(yǎng)板每孔中分別加入含藥血清使終濃度為10%，20%，每個(gè)濃度組分別設(shè)相應(yīng)濃度的空白血清組對(duì)照。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔中加入1×108個(gè)/mL細(xì)胞懸液100μL，100μg/mL的LPS使終濃度為5μg/mL，將培養(yǎng)板置5%的CO2培養(yǎng)箱飽和濕度37℃培養(yǎng)72小時(shí)。于培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，加入5mg/mL的MTT溶液10μL，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。取出培養(yǎng)板，每孔加入200μL二甲基亞砜（DMSO），靜置20分鐘，使紫色結(jié)晶呈完全溶解。，以無(wú)細(xì)胞懸液孔調(diào)零，490nm處使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.8 4種含藥血清對(duì)ConA/LPS誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響

用24孔培養(yǎng)板，每孔加入1×108個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液1mL，并加入100μg/mL的ConA/LPS溶液，使終濃度為10/5μg/mL，根據(jù)前期研究結(jié)果，確定含藥血清加入量為10%，空白血清組加入相應(yīng)的空白血清血清，將培養(yǎng)板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h后，離心，沉淀，取上清液，備用。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS12.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果用（±s）表示，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 4種含藥血清對(duì)ConA/LPS誘導(dǎo)的大鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

見(jiàn)表1、2。

表1 4種含藥血清對(duì)ConA誘導(dǎo)的大鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響（n=3，-±s）

表1 4種含藥血清對(duì)ConA誘導(dǎo)的大鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響（n=3，-±s）

注：與空白血清組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白血清+conA二冬含藥血清+conA六味含藥血清+conA二至含藥血清+conA一貫煎含藥血清+conA含藥血清濃度10%0.157±0.019 0.258±0.024**0.272±0.041**0.256±0.015**0.217±0.013*20%0.147±0.024 0.286±0.020**0.242±0.045*0.251±0.026**0.210±0.018*

表2 4種含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的B大鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響（n=3，x-±s）

表1結(jié)果表明，二冬湯含藥血清對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖均具有促進(jìn)作用，與空白對(duì)照組比有極顯著性差異（P＜0.01），且隨給藥濃度的增加其增殖效應(yīng)也增加，20%濃度的含藥血清對(duì)ConA誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)；六味地黃丸10%濃度、20%濃度的含藥血清都能增加T淋巴細(xì)胞的增殖，與空白對(duì)照組比有顯著性差異（P＜

0.05 ），其中10%濃度的效果強(qiáng)于20%濃度；二至湯和一貫煎對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖并未看出隨濃度增加效應(yīng)增大的趨勢(shì)，二至湯組與空白對(duì)照組比較有極顯著性差異（P＜0.01），一貫煎組與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表2結(jié)果表明，二冬湯含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖均具有促進(jìn)作用，與空白對(duì)照組比有極顯著性差異（P＜0.01），且隨給藥濃度的增加其增殖效應(yīng)也增加，20%含藥血清的增殖作用最強(qiáng)；六味地黃丸兩個(gè)濃度的含藥血清都能引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞增殖，與空白對(duì)照組比有顯著性差異（P＜0.05）；二至湯兩個(gè)濃度之間對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖無(wú)明顯差異，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；一貫煎對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖隨濃度增加效應(yīng)增大的趨勢(shì)，20%濃度一貫煎組與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 4種含藥血清對(duì)ConA/LPS誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響

見(jiàn)表3、4。

表3 4種含藥血清對(duì)conA誘導(dǎo)的大鼠T淋巴細(xì)胞IL-2的影響（n=3，±s）

表3 4種含藥血清對(duì)conA誘導(dǎo)的大鼠T淋巴細(xì)胞IL-2的影響（n=3，±s）

注：與空白血清組比較*P＜0.05，**P＜0.01

IL-2(pg/m L)238.24±10.72 378.24±14.38**361.10±35.72**342.0±22.15**319.19±10.53**組別脾+conA+空白血清脾+conA+二冬血清脾+conA+六味血清脾+conA+二至含藥血清脾+conA+一貫煎含藥血清

表4 4種含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠B淋巴細(xì)胞IL-2的影響（n=3，±s）

表4 4種含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠B淋巴細(xì)胞IL-2的影響（n=3，±s）

注：與空白血清組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別脾+LPS+空白血清脾+LPS+二冬血清脾+LPS+六味血清脾+LPS+二至血清脾+LPS+一貫煎含藥血清IL-2(pg/m L)150.62±6.75 218.24±10.14**168.71±7.95*183.00±5.71**159.19±6.75

表3、4表明，4種滋陰藥含藥血清可以促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞分泌白介素-2（IL2），與空白血清組比有極顯著性差異（P＜0.01），其中以二冬膏含藥血清的作用最為明顯。對(duì)于LPS誘導(dǎo)的大鼠B淋巴細(xì)胞分泌IL-2的作用，二冬含藥血清的作用最為明顯，與空白血清組比有極顯著性差異（P＜0.01）。

3 討論

中藥抗腫瘤的機(jī)理有很多種，其中滋陰藥抗腫瘤的機(jī)制主要集中在：抑制細(xì)胞增殖、提高機(jī)體免疫力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，其中提高機(jī)體免疫力是一個(gè)重要機(jī)制。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。當(dāng)宿主免疫功能低下或受抑制時(shí)，腫瘤發(fā)生率增高，而在腫瘤進(jìn)行性生長(zhǎng)時(shí)腫瘤患者的免疫功能受抑制，二者也互為因果[7]。因此，如何增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，更好地發(fā)揮機(jī)體的抗腫瘤免疫機(jī)制，已成為目前腫瘤研究的重要課題之一?？v觀腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，腫瘤細(xì)胞必須克服內(nèi)在，細(xì)胞自主和外在，免疫介導(dǎo)的屏障才能成瘤，宿主的免疫功能是決定腫瘤發(fā)生和發(fā)展的最后關(guān)卡，只有當(dāng)癌變細(xì)胞通過(guò)各種免疫逃避機(jī)制逃過(guò)免疫監(jiān)視，克服免疫功能的控制，腫瘤才能進(jìn)展或致死宿主，因此從這一角度講，腫瘤可能是一種免疫學(xué)。目前中藥抗腫瘤有扶正固本法、除痰散結(jié)法、化積消滯法、清熱解毒法、活血化瘀法、滋陰清熱法等，是現(xiàn)代中藥抗腫瘤的基本療法。藥物集中在：扶正類，如人參、甘草、黃芪、黨參；消積類，如陳皮、莪術(shù)、豬苓；還要解毒類，如半枝蓮、仙鶴草、夏枯草、白花蛇舌草[8]。目前臨床上治療腫瘤的方法雖然各不相同，但滋陰清熱是其中最為常用的治療方法之一。臨床以養(yǎng)陰清熱法治療惡性腫瘤，大都可取得提高生存質(zhì)量，減輕化療毒副反應(yīng)的效果[9-10]。大量地臨床實(shí)踐說(shuō)明陰虛與癌瘤的發(fā)生發(fā)展之間存在一定的相互關(guān)聯(lián)性。對(duì)此，我們?cè)诜治瞿壳澳[瘤發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，提出了“陰虛癌瘤相關(guān)”的新假說(shuō)，認(rèn)為滋陰法能改變腫瘤發(fā)生的內(nèi)環(huán)境，既可有效預(yù)防惡性腫瘤的發(fā)生，也能抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)[11]。

脾臟擁有全身循環(huán)T淋巴細(xì)胞的25%，直接參與細(xì)胞免疫，并對(duì)外周血中T細(xì)胞亞群的分布具有重要的調(diào)節(jié)作用，脾臟對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用是腫瘤免疫的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，B淋巴細(xì)胞約占脾內(nèi)淋巴細(xì)胞總數(shù)的55%，在腫瘤抗原刺激下轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，繼而分泌特異性抗腫瘤的免疫球蛋白IgG，且具有抗原提呈能力[12]。白介素-2（IL-2）是一種在白細(xì)胞或者免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴細(xì)胞因子，與血細(xì)胞生長(zhǎng)因子同屬細(xì)胞因子，兩者相互協(xié)調(diào)、相互作用，共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能，并在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用，同時(shí)可以促使T/B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）分泌抗體及干擾素，并產(chǎn)生抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用[13]。

本從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可見(jiàn)，四種滋陰藥含藥血清都可以促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖、促進(jìn)IL-2的分泌，提示滋陰藥主要是通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞的免疫功能達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。

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