蔡欣蕊 錢衛(wèi)斌 錢秋海 郭春芳 姜群群

(山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院2012級博士研究生，山東 濟南 250014)

實驗研究

糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織肥胖抑制素mRNA表達的影響※

蔡欣蕊 錢衛(wèi)斌1錢秋?！鞴悍?姜群群3

(山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院2012級博士研究生，山東 濟南 250014)

【摘 要】目的觀察中藥組方糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織肥胖抑制素(Obestatin) mRNA表達的影響并探討其機制。方法將60只雄性SD大鼠用鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高脂飲食制造糖尿病模型大鼠，選取40只隨機分為模型對照組、西藥對照組、糖脈通小劑量組、糖脈通大劑量組4組，每組各10只；另取10只正常大鼠為空白對照組。模型對照組以0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃給藥；糖脈通小劑量組在格列齊特20 mg/kg的基礎上，以生藥濃度為2 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃給藥；糖脈通大劑量組在格列齊特20 mg/kg的基礎上，以生藥濃度為4 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃給藥；西藥對照組在格列齊特20 mg/kg的基礎上，以濃度為1.8 mg/mL的西洛他唑混懸液10 mL/kg灌胃給藥；空白對照組以等容積蒸餾水灌胃。除空白對照組外均給予高糖高脂飼料。藥物干預12周后，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測各組大鼠血管組織Obestatin mRNA的表達。結果模型對照組、西藥對照組及糖脈通小劑量組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達水平較空白對照組明顯升高(P<0.05)；糖脈通大、小劑量組及西藥對照組血管組織中Obestatin mRNA表達較模型對照組減少(P<0.05)，且糖脈通大、小劑量組效果優(yōu)于西藥對照組(P<0.05)。結論糖脈通可能通過降低Obestatin mRNA在模型大鼠血管組織中的異常表達，對血管功能起到保護作用。

【關鍵詞】糖脈通；糖尿病血管病變；高脂血癥；疾病模型，動物；胃促生長素；RNA，信使；逆轉錄聚合酶鏈反應

糖尿病下肢動脈血管病變(lower-extremity arterial disease，LEAD)是指糖尿病患者出現(xiàn)下肢動脈粥樣硬化及微血管病變?yōu)橹饕±砀淖?，以肢端疼痛、間歇性跛行、潰瘍、壞疽為主要臨床表現(xiàn)，是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一。肥胖抑制素(Obestatin)是從大鼠胃組織中分離的一種生長素(Ghrelin)相關肽，可以結合孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR39，產生與Ghrelin相反的作用，具有非常廣泛的生物學功能。本研究通過觀察糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達水平的影響，進一步從實驗方面來驗證其療效，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠50只，體質量(200±20) g，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[動物合格證號：SCXR(魯)2009015]。普通動物飼料由山東省實驗動物中心提供，高糖高脂飼料(清潔級)由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(配方：10.0%豬油，20.0%蔗糖，10.0%蛋黃粉，0.5%膽酸鈉和59.5%常規(guī)飼料)。

1.1.2 藥物及試劑 糖脈通藥物組成：黃芪30 g，黃精30 g，桑枝15 g，地龍9 g，水蛭15 g，大血藤15 g，土茯苓30 g。實驗時制成糖脈通濃縮煎劑，分別為2、4 g/mL。西洛他唑片(100 mg/片，浙江大冢制藥有限公司，國藥準字H10960014)，格列齊特片(80 mg/片，南京瑞爾醫(yī)藥有限公司，國藥準字H20003361)。鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)：美國Sigma公司生產，北京博愛港商貿有限公司提供。超純RNA提取試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit，Transgene PCR Mix，日本TOYOBO公司；DL2000 DNA Marker，日本TAKARA公司；氯仿分析純，異丙醇，無水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)水等。

1.1.3 實驗儀器 普通高速離心機(5415D型，Eppendorf公司)；PCR儀(PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美國PE公司)；Alpha Imager TM 2200 凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech 公司)；Bio Rad 電泳儀及電泳槽(北京東方恒偉科技開發(fā)公司)；美國強生穩(wěn)豪全自動血糖儀；移液器(Gilson 產品)，Axygen無RNA酶槍頭及eppendorf管等。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法 取健康SD雄性大鼠50只，以普通動物飼料適應性喂養(yǎng)3 d后，改用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周。最后一次喂食后禁食12 h，斷尾取靜脈血測空腹血糖。然后用0.1 mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液(4 ℃，pH值=4.2)配置濃度為2%的STZ溶液，按30 mg/kg左下腹腔單次注射STZ，制造糖尿病(DM)模型。72 h后斷尾取靜脈血測空腹血糖，選空腹血糖≥16.7 mmol/L的動物作為STZ糖尿病大鼠模型，選取40只進入實驗。

1.2.2 分組及給藥 將40只成模大鼠隨機分成4組，每組10只。①模型對照組：0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃；②糖脈通小劑量組：在用格列齊特20 mg/kg的基礎上，給予生藥濃度為2 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃；③糖脈通大劑量組：在用格列齊特20 mg/kg的基礎上，給予生藥濃度為4 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃；④西藥對照組：在用格列齊特20 mg/kg的基礎上，給予濃度為1.8 mg/mL的西洛他唑混懸液10 mL/kg灌胃。另取10只正常大鼠，普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射等量無菌枸櫞酸鈉緩沖液，血糖均在4.7～7.3 mmol/L，選為空白對照組，給予等容積蒸餾水灌胃。室溫18～20 ℃，相對濕度69%，12 h交替照明，大鼠自由飲水，除空白對照組外其余各組大鼠繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)給藥觀察12周。

1.2.3 組織標本的采集 給藥觀察12周后，斷尾取靜脈血檢測各組動物空腹血糖(取血前禁食8 h)。然后用戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，開腹于脊柱旁剖離腹主動脈并截取，用0.9%氯化鈉注射液沖洗后，放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測轉化生長因子-β1(TGF-β1)。

1.2.4.1 總RNA提取 按超純RNA提取試劑盒(CW0581)說明書進行。100 mg組織標本經液氮研磨，加入1 mL Buffer RLT，室溫放置5 min，讓組織完全裂解。加200 μL氯仿，充分劇烈震蕩 15 s，室溫放置2～3 min，12 000 r/min離心15 min。將上清液轉移到新的Eppendorf管內，加等量的無水乙醇，混勻，將混合物加到離心柱上，12 000 r/min離心30 s，加異丙醇 1 700 μL，分別12 000 r/min離心30 s，加異丙醇2 500 μL 2次，12 000 r/min離心30 s，14 000 r/min離心2 min，加預熱的DEPC水50 μL，室溫放置2～3 min，12 000 r/min離心30 s，收集RNA。

1.2.4.2 RT-PCR 反應檢測Obestatin mRNA表達

逆轉錄：5×BT buffer 2 μL

Primer Mix 0.5 μL

Enzyme Mix 0.5 μL

RNA 1 μg

DEPC-H2O 補足10 μL

逆轉錄程序：37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，

PCR： 2×PCR mix 10 μL

10 μmol/L Obestatin上游引物 0.4 μL

10 μmol/L Obestatin下游引物 0.4 μL

10 μmol/L β-actin上游引物 0.2 μL

10 μmol/L β-actin下游引物 0.2 μL

RT產物 4 μL

DEPC H2O 補足20 μL

PCR程序：94 ℃3 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃5 min。

大鼠β-actin上游引物：5’-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3’，

大鼠β-actin下游引物：5’-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CTT G-3，

擴增產物：481 bp

大鼠-Obestatin上游引物：5’-ATG GTG TCT TCA GCG ACT ATC T-3’

大鼠-Obestatin下游引物：5’-CTC TGC TGG GCT TTC TGG-3’

擴增產物：113 bp

1.2.4.3 電泳及數(shù)據分析 1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染料。Alpha imager觀察電泳條帶存入圖象，β-actin的產物為481 bp，Obestatin的產物為113 bp。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY 軟件分別測量內參照和Obestatin基因擴增條帶的密度，以Obestatin條帶的密度與內參照管家基因β-actin的密度比值代表基因表達的相對水平。

2 結 果

糖脈通對模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達的影響見表1。

表1 糖脈通對模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達的影響 ±s

與空白對照組比較，*P<0.05;與模型對照組比較，△P<0.05 ;與西藥對照組比較，#P<0.05

由表1可見，模型對照組、西藥對照組及糖脈通小劑量組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達水平較空白對照組明顯升高(P<0.05)；糖脈通大、小劑量組及西藥對照組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達較模型對照組減少(P<0.05)，且糖脈通大、小劑量組效果優(yōu)于西藥對照組(P<0.05)。(見封3，圖1)。

3 討 論

LEAD屬于糖尿病動脈硬化性疾病，又稱周圍血管病變，是糖尿病最常見的慢性血管并發(fā)癥之一。血管內皮細胞是血管的基本結構，參與血管內外物質交換和血管新生等，具有重要生理作用。血管內皮細胞損傷常常是動脈粥樣硬化(AS)、糖尿病血管并發(fā)癥和高血壓等疾病的始動環(huán)節(jié)，并貫穿疾病發(fā)展的整個過程[1]。因此，對血管內皮細胞的保護已成為治療糖尿病大血管病變研究的重要方向。

某些生長因子對血管內皮細胞的正常代謝及維持血管的基本結構起著重要的作用。Ghrelin是生長激素促分泌激素受體的內源性配體，它是由28個氨基酸殘基構成的小分子短肽[2]，傳統(tǒng)認為其對食欲及糖、脂的合成代謝有重要的作用。近來有研究表明，Ghrelin還可降低血管的炎癥反應，通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的細胞核因子(NF)-κB的激活來抑制促炎癥的趨化因子白細胞介素-8(IL-8)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達，從而抑制早期AS的發(fā)生[3]。Obestatin是2005年從大鼠胃組織中分離的一種Ghrelin相關肽，它可以結合孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR39，產生與Ghrelin相反的作用[4]。Obestatin亦具有非常廣泛的生物學功能，除負向調節(jié)攝食和胃腸運動外[4]，也可作用于胰腺胰島組織抑制胰島素、胰多肽、生長抑素等的分泌[5]。另有研究表明Obestatin與各種糖、脂代謝因素密切相關[6]。鑒于對心血管尤其是血管內皮細胞的保護作用，Ghrelin與Obestatin已逐漸成為糖尿病大血管病變的研究熱點。

本實驗通過觀察糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達的影響。結果顯示模型大鼠血管內皮細胞中Obestatin mRNA的表達明顯升高，而糖脈通可顯著抑制Obestatin mRNA在血管內皮的異常表達，效果優(yōu)于西藥對照組。提示糖脈通可能通過抑制Obestatin mRNA在血管內皮的異常表達起到保護血管內皮、延緩血管病變病程的作用。

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EffectofTangmaitongonmRNAexpressionofObestatinininthevasculartissueofdiabeticratsmodel

CAIXinrui*,QIANWeibin,QIANQiuhai,etal.

*2012Doctor-postgraduate,TheFirstClinicalMedicalCollegeofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineShandong,Jinan250014

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and mechanisms of Tangmaitong on mRNA expression of Obestatin in the vascular tissue of diabetic rat’s model.Method Rat diabetic model were made with STZ and high-quality and high-carbohydrate diet.40 diabetic model rats were randomly divided into four groups,model group,western medicine group,high-and low-dose Tangmaitong group.10 normal rats were as control group.Model group received 0.9% NaCl solution,high-and low-dose Tangmaitong groups received 10mL/kg(2 g/mL,4 g/mL crude drug) on the basis of Gliclazide,20mg.kg.Rat in western medicine group received 10 mL/kg(Cilostazol suspension 1.8 mg/mL) on the basis of Gliclazide,20mg.kg.Control group received equal volume of distilled water.After 12 weeks of drug intervention,rats were killed,the vascular were removed and the mRNA expression of Obestatin in the vascular was observed by the method of RT-PCR.ResultsThe mRNA expression of Obestatin was significantly increased,and Tangmai-tong could lower the mRNA expression of Obestatin in the vascular in a dose-dependent manner.The decrease of the mRNA expression of Obestatin in high-and low-dose Tangmaitong group was superior to that in western medicine group(P<0.05).ConclusionTangmaitong can play a protective effect on vascular function by reducing the abnormal expression of Obestatin in the vascular tissue of diabetic rat’s model,and deserves further research.

【Key words】Tangmaitong; Diabetic angiopathies; Hyperlipemia; Disease model; Animal; Ghrelin; RNA; Messenger; RT-PCR

【中圖分類號】R587.230.531；R589.210.531；R342.22

A

1002-2619(2013)12-1868-03

※ 項目來源：山東省科學技術發(fā)展計劃項目(編號：2010GSF10242)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(編號：2009Z004)

山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內分泌科，山東 濟南 250011

1 日本鳥取大學醫(yī)學部，日本 鳥取 683-8503

2 山東省禹城市人民醫(yī)院內分泌科，山東 禹城 251200

3 中國人民解放軍第一○七醫(yī)院內分泌科，山東 煙臺 264000

蔡欣蕊(1985—)，女，博士研究生在讀，碩士。研究方向：中醫(yī)內科學專業(yè)。

2013-06-17)