王 瑞， 陳永忠， 羅 健， 陳隆升， 彭邵鋒，王湘南， 馬 力， 楊小胡

(1.國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

抗生素及防腐劑在油茶組織培養(yǎng)中的抑菌效應(yīng)研究

王 瑞1,2， 陳永忠1,2， 羅 健1,2， 陳隆升1,2， 彭邵鋒1,2，王湘南1,2， 馬 力1,2， 楊小胡1,2

(1.國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

針對(duì)油茶組織培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染問(wèn)題，在繼代培養(yǎng)基中分別添加不同種類(lèi)和質(zhì)量濃度的抗生素和防腐劑，結(jié)果表明： (1)培養(yǎng)基中添加鏈霉素20mg/L抑菌效果最佳，污染率為0，其次為青霉素G鈉鹽、青霉素G鈉鹽+四環(huán)素、四環(huán)素，多粘菌素B抑菌效果最差； (2)采用苯甲酸鈉、山梨酸鉀作為抑菌劑，污染率均在92%以上； (3)以添加抗生素鏈霉素20mg/L的培養(yǎng)基苗木生長(zhǎng)狀況最佳，增殖系數(shù)為3.69，葉片數(shù)為3.73，苗木生長(zhǎng)量為2.20cm。

油茶； 組培苗； 抗生素； 防腐劑； 抑菌效應(yīng)

真菌和細(xì)菌污染已成為植物組織培養(yǎng)的限制因子，其中細(xì)菌污染是最嚴(yán)重的，染菌的組培苗很難生根，即使生根，移栽成活率也很低，污染在植物組培中造成的危害很大[1-2]。組織培養(yǎng)過(guò)程中污染的防治一般是用抗生素[3-5]，不同的植物所選用抗生素種類(lèi)及濃度也不一樣，Young等[6]研究表明培養(yǎng)基中加入濃度分別為25、25、6和6mg/L的頭孢菌素、四環(huán)素、利福平和多粘菌素B的混合物，蘋(píng)果和杜鵑污染組培苗中細(xì)菌完全被消除；田永亮等[7]發(fā)現(xiàn)葡萄污染組培苗，四環(huán)素的抑菌作用比青霉素的抑菌作用好；周俊輝等[8]研究了丙酸鈉和磷酸鈉對(duì)污染試管苗的影響，0.3%丙酸鈉抑菌效果較好；馬翠萍[9]發(fā)現(xiàn)0.14%苯甲酸和0.16%山梨酸效果最佳，且對(duì)組培苗生長(zhǎng)的抑制作用不大。

油茶是我國(guó)重要的木本油料樹(shù)種，油茶組培快繁技術(shù)對(duì)緩解油茶苗木緊張、加快油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大[10-12]。細(xì)菌污染在油茶組培中也較常見(jiàn)，但大多報(bào)道是關(guān)于油茶外植體滅菌技術(shù)的研究[13-15]，至今未曾見(jiàn)過(guò)關(guān)于油茶組培苗細(xì)菌污染防治的研究。我們研究了抗生素及防腐劑對(duì)油茶組培苗細(xì)菌污染的防治，旨在為建立無(wú)細(xì)菌干擾的油茶組培快繁體系提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用已污染細(xì)菌的油茶組培苗?？股胤謩e采用多粘菌素B(Polymyxin B Sulfate)、青霉素G鈉鹽(Penicinllin G sodium)、鏈霉素(Streptomycin)、四環(huán)素(Tetracycline)，防腐劑分別采用苯甲酸鈉(Sodium benzoate)、山梨酸鉀(Potassium sorbate)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 不同種類(lèi)抗生素的抑菌效果試驗(yàn)。4種抗生素及其質(zhì)量濃度水平見(jiàn)表1，以不加抗生素的培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)處理5瓶，每瓶6個(gè)外植體，3次重復(fù)。

表1 抗生素的種類(lèi)及質(zhì)量濃度Tab.1 Sortsandconcentrationsofantibiotics處理號(hào)抗生素種類(lèi)質(zhì)量濃度(mg/L)1多粘菌素B 52多粘菌素B103青霉素G鈉鹽104青霉素G鈉鹽205鏈霉素106鏈霉素207四環(huán)素108四環(huán)素209青霉素G鈉鹽+四環(huán)素10+1010青霉素G鈉鹽+四環(huán)素20+2011CK

(2) 不同種類(lèi)防腐劑的抑菌效果試驗(yàn)。2種防腐劑及其質(zhì)量濃度水平見(jiàn)表2，以不加防腐劑的培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)處理5瓶，每瓶6個(gè)外植體，3次重復(fù)。

1.2.2 試驗(yàn)方法 將帶菌的繼代油茶組培苗接種于添加不同種類(lèi)和質(zhì)量濃度抗生素和防腐劑的繼代培養(yǎng)基上(WPM+BA 3.0mg/L+IBA 0.5mg/L)，添加蔗糖30g/L、瓊脂6g/L，pH 5.8。抗生素溶液在超凈工作臺(tái)上以0.22μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾后，根據(jù)設(shè)計(jì)濃度按所需量加入已滅菌尚未凝固的培養(yǎng)基中，并分裝。培養(yǎng)40d后調(diào)查每個(gè)處理的芽苗污染數(shù)、增殖系數(shù)及苗木生長(zhǎng)情況。

表2 防腐劑的種類(lèi)及質(zhì)量濃度Tab.2 Sortsandconcentrationsofpreservatives處理號(hào)防腐劑種類(lèi)質(zhì)量濃度(mg/L)1苯甲酸鈉0.22苯甲酸鈉0.43苯甲酸鈉0.64山梨酸鉀0.55山梨酸鉀1.06CK

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對(duì)油茶組培苗的抑菌效果

多粘菌素B、青霉素G鈉鹽、鏈霉素、四環(huán)素等4種不同濃度的不同抗生素對(duì)油茶組培苗抑菌效果見(jiàn)表3。從表3可知，不同種類(lèi)及不同濃度抗生素處理間油茶組培苗污染率存在極顯著差異(F=7.6700，p=0.0001)，不同種類(lèi)的抗生素，隨濃度的增加，污染率降低，抑菌效果增強(qiáng)。鏈霉素抑菌效果最佳，其次為青霉素G鈉鹽、青霉素G鈉鹽+四環(huán)素、四環(huán)素，多粘菌素B抑菌效果最差。

培養(yǎng)基同時(shí)添加青霉素G鈉鹽和四環(huán)素，污染率分別為43.34%、8.35%，其污染率雖低于添加四環(huán)素的培養(yǎng)基，但高于添加青霉素G鈉鹽的培養(yǎng)基，說(shuō)明這兩種抗生素聯(lián)用不能起到協(xié)同作用。處理2～10污染率均低于對(duì)照，以處理6(鏈霉素20mg/L)抑菌效果最好，污染率為0。

表3 不同抗生素處理間油茶組培苗污染率差異性比較Tab.3 Comparisonofdifferentiationofcontaminationrateondifferentsortsandconcentrationsofantibiotics處理號(hào)抗生素種類(lèi)質(zhì)量濃度(mg/L)污染率均值(%)1多粘菌素B 5100.00aA 2多粘菌素B1063.34abcAB3青霉素G鈉鹽1026.68cdeBCD4青霉素G鈉鹽203.34deD5鏈霉素1075.00abAB6鏈霉素200.00eD7四環(huán)素1060.00bcABC8四環(huán)素2013.34deCD9青霉素G鈉鹽+四環(huán)素10+1043.34bcdBCD10青霉素G鈉鹽+四環(huán)素20+208.35deCD11CK100.00aA

2.2 防腐劑對(duì)油茶組培苗的抑菌效果

苯甲酸鈉、山梨酸鉀等2種不同濃度的不同防腐劑對(duì)油茶組培苗抑菌效果見(jiàn)表4。從表4可知，不同種類(lèi)及不同濃度防腐劑處理間油茶組培苗污染率不存在顯著差異(F=0.930 0，p=0.479 3)，采用苯甲酸鈉、山梨酸鉀作為抑菌劑，污染率均在92%以上，說(shuō)明防腐劑對(duì)油茶組培苗抑菌效果差，不宜用作油茶組培苗的抑菌劑。

表4 不同防腐劑處理間油茶組培苗污染率差異性比較Tab.4 Comparisonofdifferentiationofcontaminationrateondifferentsortsandconcentrationsofpreservatives處理號(hào)防腐劑種類(lèi)質(zhì)量濃度(mg/L)污染率均值(%)1苯甲酸鈉0.296.662苯甲酸鈉0.492.003苯甲酸鈉0.692.004山梨酸鉀0.5100.005山梨酸鉀1.0100.006CK100.00

2.3 抗生素對(duì)油茶組培苗分化、生長(zhǎng)的影響

添加不同抗生素的培養(yǎng)基上油茶組培苗的增殖系數(shù)、葉片數(shù)及苗木生長(zhǎng)量見(jiàn)表5。經(jīng)方差分析，不同抗生素處理間苗木增殖系數(shù)、葉片數(shù)、苗木生長(zhǎng)量均存在極顯著差異(苗木增殖系數(shù)F=10.475 0，p=0.0001；葉片數(shù)F=3.899 0，p=0.000 9；苗木生長(zhǎng)量F=13.545 0，p=0.000 1)。

從表5可知，處理1～10油茶組培苗各項(xiàng)指標(biāo)均高于對(duì)照，說(shuō)明抗生素的添加不會(huì)影響已污染組培苗的生長(zhǎng)。增殖系數(shù)以處理6(鏈霉素20mg/L)最佳，為3.69；葉片數(shù)以處理8(四環(huán)素20mg/L)最佳，為4.30；苗木生長(zhǎng)量以處理8(四環(huán)素20mg/L)最佳，為2.28cm，處理6次之，為2.20cm，兩者間不存在顯著差異。綜合上述分析，以處理6(鏈霉素20mg/L)苗木生長(zhǎng)狀況最佳。

表5 不同抗生素處理間油茶組培苗增殖系數(shù)、葉片數(shù)、苗木生長(zhǎng)量差異性比較Tab.5 Comparisonofdifferentiationofmultiplicationcoefficient,leafnumber,growthincrementofseedlingsondiffer-entsortsandconcentrationsofantibiotics處理號(hào)抗生素種類(lèi)質(zhì)量濃度(mg/L)增殖系數(shù)均值葉片數(shù)均值苗木生長(zhǎng)量均值(cm)1多粘菌素B51.27fE3.82abAB0.92cC2多粘菌素B101.70efDE3.13bcBCD1.13bcC3青霉素G鈉鹽102.40cdeBCD2.69cdCD1.16bcC4青霉素G鈉鹽202.07deDE3.20bcBCD1.11bcC5鏈霉素102.50bcdBCD3.07bcdB-CD0.93bcC6鏈霉素203.69aA3.73abABC2.20aA7四環(huán)素103.13abAB3.53ab-cABC1.90aAB8四環(huán)素203.17abAB4.30aA2.28aA9青霉素G鈉鹽+四環(huán)素10+103.04abcABC3.65abABC2.15aA10青霉素G鈉鹽+四環(huán)素20+202.19deCD3.60abABC1.38bBC11CK1.21fE2.24dD0.86cC

2.4 防腐劑對(duì)油茶組培苗分化、生長(zhǎng)的影響

添加不同防腐劑的培養(yǎng)基上油茶組培苗的增殖系數(shù)、葉片數(shù)及苗木生長(zhǎng)量見(jiàn)表6。經(jīng)方差分析，不同防腐劑處理間苗木增殖系數(shù)及葉片數(shù)均不存在顯著差異(苗木增殖系數(shù)F=1.264 0，p=0.311 6；葉片數(shù)F=1.949 0，p=0.123 3)，苗木生長(zhǎng)量存在顯著差異(F=2.949 0，p=0.032 6)。

從表6可知，處理1、3的增殖系數(shù)大于對(duì)照，以處理1最佳，為1.41，處理3次之，為1.35；葉片數(shù)以處理3最佳，為2.86；苗木生長(zhǎng)量以處理3最佳，為1.10cm。綜合上述分析，以處理3(苯甲酸鈉0.6mg/L)苗木生長(zhǎng)狀況最佳。

表6 不同防腐劑處理間油茶組培苗增殖系數(shù)、葉片數(shù)、苗木生長(zhǎng)量差異性比較Tab.6 Comparisonofdifferentiationofmultiplicationcoefficient,leafnumber,growthincrementofseedlingsondiffer-entsortsandconcentrationsofpreservatives處理號(hào)防腐劑種類(lèi)質(zhì)量濃度(mg/L)增殖系數(shù)均值葉片數(shù)均值苗木生長(zhǎng)量均值(cm)1苯甲酸鈉0.21.412.58a1.05ab2苯甲酸鈉0.41.082.53ab1.05ab3苯甲酸鈉0.61.352.86a1.10a4山梨酸鉀0.51.102.73a1.05ab5山梨酸鉀1.01.001.63b0.81c6CK1.212.24ab0.86bc

3 結(jié)論與討論

(1) 在培養(yǎng)基中添加一定濃度的單一種類(lèi)的抗生素，能夠有效抑制油茶組培中外植體與培養(yǎng)基接觸處產(chǎn)生的白色水漬狀細(xì)菌污染。本研究中，鏈霉素抑菌效果最佳，培養(yǎng)基中添加鏈霉素20mg/L可使油茶組培苗污染率降為0，其次為青霉素G鈉鹽、青霉素G鈉鹽+四環(huán)素、四環(huán)素，多粘菌素B抑菌效果最差。青霉素G鈉鹽+四環(huán)素兩種抗生素聯(lián)用未起到協(xié)同作用，未降低污染率，與翟建中、周俊輝等研究結(jié)果不同[16-19]。

(2) 采用苯甲酸鈉、山梨酸鉀作為抑菌劑，污染率均在92%以上，說(shuō)明防腐劑對(duì)油茶組培苗抑菌效果差，不宜用作油茶組培苗的抑菌劑。

(3) 不同抗生素對(duì)油茶組培苗分化、生長(zhǎng)的影響，以添加鏈霉素20mg/L的培養(yǎng)基苗木生長(zhǎng)狀況最佳，增殖系數(shù)為3.69，葉片數(shù)為3.73，苗木生長(zhǎng)量為2.20cm。不同防腐劑對(duì)油茶組培苗分化、生長(zhǎng)的影響，以添加苯甲酸鈉0.6mg/L的培養(yǎng)基苗木生長(zhǎng)狀況最佳，增殖系數(shù)為1.35，葉片數(shù)為2.86，苗木生長(zhǎng)量為1.10cm，其苗木生長(zhǎng)狀況差于添加抗生素鏈霉素20mg/L的培養(yǎng)基。

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(文字編校：張 珉)

BacteriostaticefficacyofantibioticandpreservativeintissuecultureofCamelliaoleifera

WANG Rui1,2, CHEN Yongzhong1,2, LUO Jian1,2,CHEN Longsheng1,2, PENG Shaofeng1,2, WANG Xiangnan1,2, MA Li1,2, YANG Xiaohu1,2

(1.National Oil-tea Camellia Engineering & Technology Research Center, Changsha 410004, China; 2.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China)

In order to solve the problem of contamination during the process of tissue culture ofCamelliaoleifera, different sorts and concentrations of antibiotics and preservatives were added to medium separately. The results showed that :(1)Medium adding with streptomycin 20 mg/L was most effective, the contamination rate was 0%, the next were penicillin G sodium, penicillin G sodium + tetracycline, tetracycline, and the effective of Polymyxin B Sulfate was the worst. (2) Medium adding with sodium benzoate and potassium sorbate, the contamination rate was over 92%. (3) Medium adding with streptomycin 20 mg/L was most effective, and the proliferation coefficient was 3.69, leaf number was 3.73, growth increment of seedlings was 2.20 cm.

Camelliaoleifera; tissue culture seedling; antibiotic; preservative; bacteriostatic efficacy

2013 — 05 — 02

長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃項(xiàng)目(K1201012-61)；湖南省林業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基金項(xiàng)目“油茶組培苗生根體系建立及生根機(jī)理研究”。

王 瑞(1983 — )，女，山東省東營(yíng)市人，助理研究員，在讀博士，主要從事油茶良種繁育研究。

Q 943.1

A

1003 — 5710(2013)04 — 0025 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2013. 04. 007