張輝,喬勇進(jìn),戚文元
1(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所,上海,201403)
2(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海,200093)3(上海束能輻照技術(shù)有限公司,上海,201401)
大麥(Hordeum vulgare),屬大麥屬(Hordeum),早熟禾科(Poaceae),其嫩苗富含葉綠素、類黃酮、維生素、抗氧化酶及蛋白質(zhì)等多種功能營養(yǎng)成分[1-2]。據(jù)報(bào)道大麥苗黃酮類化合物主要有皂草苷(saponarin)和大麥黃苷(lutonarin)[3-4],其自由基清除能力和抗氧化性能顯著高于其他植物黃酮和黃酮碳苷[5],具有抗癌、抗炎及防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等生理功能[6-7]。目前,天然植物黃酮類化合物提取原料有銀杏葉[8]、杜仲葉[9]及玉米須[10]等。以大麥苗為原料進(jìn)行總黃酮定向提取并對其提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化的研究鮮有報(bào)道。大麥苗因其原料具有種植周期短、成本低、產(chǎn)量大、易加工及副產(chǎn)物利用價(jià)值大等優(yōu)點(diǎn),可作為總黃酮提取的原料。已有研究表明超臨界流體萃取、超聲波及微波輔助提取可增加植物黃酮類化合物的提取量[11-13],而本文以乙醇溶液為提取溶劑,對大麥苗總黃酮進(jìn)行常溫浸漬提取,采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(central composite design,CCD),優(yōu)化其最佳工藝條件。
六葉期大麥苗(品種:大中88-91),采收于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田;無水乙醇(分析純 )、NaNO2(BR)、AlCl3(BR)、NaOH(BR)、蘆丁(純度 >95%),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
1.3.1 葉綠素提取工藝流程
大麥苗鮮樣→挑選、清洗、瀝干→真空冷凍干燥(預(yù)凍溫度,-45℃;冷阱溫度,-37℃;升華溫度,25℃;真空度,170 Pa)→粉碎(100目)→浸提→過濾→濾液→減壓濃縮成膏狀(水浴溫度,30℃;真空度,110 Pa)
1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比和提取時(shí)間等3個(gè)因素均對大麥苗總黃酮提取量影響較大。故分別取其不同水平進(jìn)行單因素試驗(yàn),每組試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn),取其平均值進(jìn)行研究。
1.3.2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對大麥苗總黃酮提取效果的影響
將粉碎干燥后的大麥苗過100目篩,稱取麥苗粉約2.50 g,置于250 mL錐形瓶中,按液固比為30∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液,用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃浸提90 min,研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對大麥苗總黃酮提取效果的影響。
在經(jīng)歷了這樣特殊的課程之后,從新加坡中學(xué)走出來的學(xué)生具有非常敏銳的“批判性思維”和“辯證思維”,他們的邏輯思維能力快速成長,也同樣對于他們的學(xué)術(shù)課程大有助益。
1.3.2.2 不同液固比對大麥苗總黃酮提取效果的影響
將粉碎干燥后的大麥苗過100目篩,稱取麥苗粉約2.50 g,置于250 mL錐形瓶中,按液固比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液,用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃浸提90 min,研究不同液固比對大麥苗總黃酮提取效果的影響。
1.3.2.3 不同提取時(shí)間對大麥苗總黃酮提取效果的影響
將粉碎干燥后的大麥苗過100目篩,稱取麥苗粉約2.50 g,置于250 mL錐形瓶中,按液固比為30∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液,用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃分別浸提 30、60、90、120、150 min,研究不同提取時(shí)間對大麥苗總黃酮提取效果的影響。
1.3.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對大麥苗總黃酮提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定了CCD的試驗(yàn)水平(表1)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,可建立二次非線性回歸模型(式 1)[14]。
式中:Y,總黃酮提取量預(yù)測值;Xi,Xj,試驗(yàn)因素的編碼值;β0,βii,βij,截距及回歸常數(shù)(其中,Xi=,式中X為無量綱的編碼值,x為變量i的實(shí)ii際值,xio為變量i的零水平實(shí)際值。Δxi為變量i的步長實(shí)際值,即編碼值變化一個(gè)單位所對應(yīng)的實(shí)際變化值)。
因子貢獻(xiàn)率采用式(2)計(jì)算[15]:
式中:SSj,因子平方和,SST,模型總平方和。
表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及編碼水平Table 1 Values factors and their coded levels in central composite experimental design
1.3.4 指標(biāo)測定
浸提完成后將提取液置于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下低溫(10℃)離心15 min,取1 mL上清液,采用硝酸鋁比色法[16]測定其總黃酮含量。總黃酮提取量采用式(3)進(jìn)行計(jì)算。
式中:Y,大麥苗總黃酮提取量,μg/g;m,提取液中總黃酮含量,μg/mL;M,提取樣品質(zhì)量,g。
1.3.5 數(shù)據(jù)處理
CCD試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0.6.1(State-Ease,Inc.,USA)、SAS 9.2(SAS Inc.,USA),Origin 8.0(Electronic Arts Inc.,USA)繪制單因素圖及效應(yīng)圖。
圖1表明,大麥苗總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí),總黃酮提取量最高。這可能是由于大麥苗中黃酮類化合物為弱極性物質(zhì),乙醇體積分?jǐn)?shù)越大,其極性越接近大麥苗中黃酮類化合物的極性,導(dǎo)致總黃酮溶出量升高。
圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the flavonoids extraction yield
液固比對液相主體和固相主體之間的濃度差,即傳質(zhì)推動(dòng)力,影響較大。此外,液固比也會(huì)影響液固兩相的表觀傳質(zhì)系數(shù),從而影響傳質(zhì)速率。圖2表明,隨著液固比的增加,大麥苗總黃酮提取量呈現(xiàn)先快速升高而后增加平緩的趨勢。這是因?yàn)樵黾右汗瘫龋瑐髻|(zhì)動(dòng)力增加,黃酮就更容易溶出,損失減少;但液固比大于30 mL/g后增加速度趨于平緩。由于液固比較大會(huì)造成提取溶劑的浪費(fèi)及后期濃縮的困難,從總黃酮提取效果和經(jīng)濟(jì)邊際效應(yīng)兩方面綜合考慮,認(rèn)為進(jìn)行大麥苗總黃酮提取時(shí)液固比不宜高于40 mL/g。
圖2 液固比對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the flavonoids extraction yield
由圖3可知,總黃酮提取量隨著提取時(shí)間的延長呈現(xiàn)先逐漸升高而后降低的趨勢。大麥苗總黃酮提取量在提取時(shí)間為120 min時(shí)達(dá)到最大值,而在提取時(shí)間為150 min時(shí)略微降低。這可能因?yàn)檠娱L提取時(shí)間使得更多的黃酮類化合物溶出,但一些黃酮類化合物易于氧化,提取時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致總黃酮的溶出量小于其降解量,從而使得其提取量略微降低。
圖3 提取時(shí)間對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the flavonoids extraction yield
2.2.1 回歸模型的建立
試驗(yàn)共設(shè)20次試驗(yàn),其中包括14次析因試驗(yàn)及6次中心點(diǎn)試驗(yàn)。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn),取其平均值作為響應(yīng)值,試驗(yàn)按隨機(jī)順序進(jìn)行,其結(jié)果見表2。
利用Design-Expert 8.0軟件對表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并建立三元二次回歸方程(式3):
表2 CCD設(shè)計(jì)矩陣及響應(yīng)值Table 2 Central composite design matrix and responses
2.2.2 回歸模型的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)
由表3可知,判定系數(shù)(R2)為0.994 3,說明模型相關(guān)性較好,試驗(yàn)因子對響應(yīng)值有較大影響。校正判定系數(shù)(adjR2)為0.989 1,表明98.91%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。變異系數(shù)(C.V.)為1.66%,表示試驗(yàn)的可信度和精確度較好。本試驗(yàn)精密度(adeq precision)為40.536 >4.0,表明其為一個(gè)適宜的信號。模型 F值為192.61,表明其達(dá)到極顯著水平(P<0.01),即乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比及提取時(shí)間等影響因素對總黃酮提取量的共同影響具有差異極顯著性,且模型一次項(xiàng)、二次項(xiàng)均達(dá)到顯著水平。此外,失擬F值為1.54(P=0.323 2>0.05),表明失擬值和純誤差沒有顯著性關(guān)系,即回歸模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域不失擬。綜上可知,該所建立模型可用于指導(dǎo)試驗(yàn)。此外,表3還表明,各一次項(xiàng) 、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)X2X3、X1X3均對大麥苗總黃酮提取量影響極顯著(P<0.01),交互項(xiàng)X1X2對總黃酮提取影響不顯著 (P>0.05)。
表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of regression model significance test
圖4 因子貢獻(xiàn)率Fig.4 Percentage contributions of factors
2.2.3 模型效應(yīng)分析
2.2.3.1 主效應(yīng)分析
由于模型存在交互效應(yīng),故不宜采用回歸系數(shù)的絕對值大小來直接比較二次項(xiàng)、交互項(xiàng)作用的大小。因此,本試驗(yàn)均采用因子貢獻(xiàn)率來衡量各因子對總黃酮提取量的影響大小。圖4-a表明,二次項(xiàng)效應(yīng)>一次項(xiàng)效應(yīng)>交互項(xiàng)效應(yīng)。圖4-b表明,模型各項(xiàng)間乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次效應(yīng)影響最顯著,其次是其液固比,而乙醇體積分?jǐn)?shù)及液固比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對黃酮提取量影響最小。3個(gè)試驗(yàn)因素的效應(yīng)大小依次為液固比 >提取時(shí)間 >乙醇體積分?jǐn)?shù)。
2.2.3.2 兩因素效應(yīng)分析
由圖5-a、5-c知,大麥苗總黃酮的提取量隨液固比的增加呈現(xiàn)先快速增長再緩慢增長的趨勢。液固比的增加可增加傳質(zhì)動(dòng)力,有助于總黃酮的溶出,但當(dāng)液固比達(dá)到一定程度時(shí),已溶出大部分總黃酮,若再增加液固比,則總黃酮提取量增加緩慢。由5-a、5-e可看出,總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增大而后減小的趨勢。這可能是由于在一定范圍內(nèi),乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大減小了提取液極性,使其更接近于總黃酮的極性,從而增加了總黃酮的溶出。但過度增加乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)導(dǎo)致提取液極性過小,從而偏離大麥苗總黃酮極性。5-c、5-e均表明,大麥苗總黃酮提取量隨著提取時(shí)間的延長曾先前期增加迅速,后期增加緩慢的趨勢。這可能是由于前期已溶出大部分黃酮,后期原料自身黃酮較少,故增加緩慢;也可能由于后期有部分黃酮發(fā)生降解,但降解速率仍小于溶出速率,從而呈現(xiàn)增長緩慢的現(xiàn)象。圖5-b為液固比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線圖,其接近圓形,表明二者交互作用不顯著,圖5-d、5-e分別為液固比與提取時(shí)間的等高線圖及乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的等高線圖,其均為橢圓形狀,表明二者交互效應(yīng)顯著,這均與方差分析結(jié)果一致。
圖5 總黃酮提取量響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots of total flavonoids extraction yield
規(guī)范分析[17](canonical analysis)能求出響應(yīng)面的拐點(diǎn)并判斷其類型(最大值點(diǎn)、最小值點(diǎn)、馬鞍形點(diǎn))。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行規(guī)范分析(表4),得到大麥苗總黃酮提取的一個(gè)穩(wěn)定點(diǎn),該點(diǎn)處理論響應(yīng)值為950.36。由于變量X2的編碼值的特征值為0.02,其較接近零值,在試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)可能會(huì)存在一個(gè)穩(wěn)定嶺系統(tǒng),故一般需進(jìn)行嶺脊分析。
表4 規(guī)范分析結(jié)果Table 4 Results of canonical analysis
嶺脊分析(aidge analysis)是在以原始設(shè)計(jì)中心點(diǎn)為球心,以r為半徑的超球面與響應(yīng)面的交點(diǎn)所形成的軌跡范圍內(nèi)探測最佳響應(yīng)值[17]。嶺脊分析結(jié)果(表 5)表明當(dāng)超球面半徑(r)為 0.8,X1、X2、X3的特征值分別為 0.728 876、0.021 37、0.329 069 時(shí),響應(yīng)值達(dá)到最大(950.346 3 μg/g),其與規(guī)范分析所得的穩(wěn)定點(diǎn)較一致,故無穩(wěn)定嶺系統(tǒng)的存在,穩(wěn)定點(diǎn)為理論上的最優(yōu)點(diǎn)。
表5 脊嶺分析結(jié)果Table 5 Results of ridge analysis
考慮到試驗(yàn)操作的便利,將總黃酮提取工藝參數(shù)修正為液固比29、乙醇體積分?jǐn)?shù)90% 、提取時(shí)間100 min。采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果測得大麥苗總黃酮提取量為946.63 μg/g,與模型預(yù)測值相差 3.73 μg/g,差異在誤差允許范圍內(nèi)。
本試驗(yàn)通過CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了影響因子與大麥苗總黃酮提取量之間的三元二次回歸模型,確定了大麥苗總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為液固比29 mL/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)90% 、提取時(shí)間100 min,在此工藝條件下,大麥苗總黃酮提取量為946.63 μg/g,其與預(yù)測值950.36 μg/g較一致。故該模型能反映大麥苗總黃酮提取過程的內(nèi)部規(guī)律,可較好地預(yù)測大麥苗總黃酮的提取情況,并能為黃酮類化合物提取原料的來源、進(jìn)一步提高大麥嫩苗資源利用率及大麥苗黃酮類化合物工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。
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