郭萌萌，李志文，張平，農(nóng)紹莊，劉莉，劉翔

1(大連工業(yè)大學，食品學院，遼寧 大連，116000)

2(國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心(天津)，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津，300384)

3(天津大學，環(huán)境科學與工程學院，天津，300072)

灰霉病(gray mold)由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起，可危害番茄、黃瓜、葡萄等作物，在果蔬貯藏期間可以導致其腐爛，降低品質。該菌在低溫條件下(－0.5℃)仍能生長繁殖，而葡萄對其抵抗力較弱，因此必須采取相應防腐措施以免葡萄貯藏過程中受到病菌的侵害［1］。目前生產(chǎn)中常用的葡萄防腐手段主要為冷藏、窖藏及氣調等物理方法和二氧化硫熏蒸、化學涂層及防腐劑等化學方法［2］，然而廣泛使用的SO2熏蒸法在葡萄采后的儲藏過程中可造成香氣成分減少或不良氣味的增加等影響［3］。

納他霉素作為多烯類大環(huán)內酯類抗生素的一種，可通過直接抑制氨基酸和葡萄糖的跨膜運輸達到抑制真菌生長的效果［4］，在很低的濃度下就具有有效的抑制作用，是一種高效、廣譜的真菌抑制劑，且對動物細胞的毒性極低。因此，納他霉素目前已應用于多類食品的防腐保鮮中，但在葡萄等果蔬的防腐保鮮方面的研究較少，而關于采前納他霉素處理對果蔬采后防腐保鮮作用的研究更是鮮有報道。本研究以傳統(tǒng)食品防腐劑山梨酸鉀為對照，測定納他霉素抑菌液對葡萄采后灰霉菌抑制毒力，分析采前納他霉素處理對采后葡萄貯藏過程中品質及代謝生理指標的作用效果，從而為葡萄采后生物保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

納他霉素95%原粉，由北京東方瑞德生物技術公司提供?；颐咕刹珊蟾癄€葡萄上分離純化得到(本實驗室分離得到)。供試葡萄品種為“玫瑰香”，于2012年9月23日在天津漢沽茶淀葡萄園選擇無腐爛、無落粒和無機械傷的果實進行采前浸果處理，于9月24日運回國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心(天津)進行貯藏試驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 處理方法

1.2.1.1 離體抑菌液處理

(1)不同濃度納他霉素抑菌液:精確配制質量濃度為1 g/L的納他霉素0.1%檸檬酸抑菌液，再將其以0.1%的檸檬酸稀釋至質量濃度0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 g/L。

(2)不同濃度山梨酸鉀抑菌液:精確配制質量濃度為10 g/L的山梨酸鉀20%乙醇抑菌液，再將其以20%乙醇稀釋至質量濃度 5、2.5、1、0.5、0.25 g/L。

(3)對照溶液:CKA:0.1%的檸檬酸溶液;CKB:20%乙醇。

1.2.1.2 采前抑菌液處理

葡萄采收前1天晴天的早上8點開始，選擇樹勢一致、盡量處于樹體同一位置及無腐爛無霉變無機械損傷和相同成熟度的果實進行浸果試驗，參考納他霉素和山梨酸鉀抑制灰霉菌的EC50值分別選取濃度為0.5 g/L的納他霉素抑菌液及5 g/L的山梨酸鉀抑菌液，并將配制好的抑菌液倒入相同容積的容器中，然后將整串葡萄浸入藥劑當中，計時1 min，保證果穗均勻浸藥，分別以不同顏色的彩帶標記不同濃度處理，以未進行浸果處理的果實作為對照(CK)。

1.2.1.3 貯藏試驗

將處理過的果實采收后運回國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心，在保鮮庫［0±0.5)℃］中預冷24 h，再稱取2.5 kg/袋小心放入PE保鮮袋(國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心提供)中，然后整齊放入可周轉塑料果實包裝箱中，每箱放1袋，最后將其放入保鮮庫［(0±0.5)℃］中進行貯藏。每20 d各處理取出3箱果實，隨機取樣調查，進行相關指標測試。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 病原菌的純化與鑒定

供試菌種于2012年9月23日采自天津漢沽茶淀葡萄園發(fā)病的葡萄果實。病果分裝于潔凈紙質樣品袋中，防止污染。取典型癥狀的病果，經(jīng)酒精消毒后，于無菌條件下，用消毒解剖刀在果實病斑中部縱切一刀，用接種針挑取一小塊病果果肉組織，接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)72 h。待長出菌落后，再挑取目標菌落邊沿部分接種到新的PDA平板培養(yǎng)基上，依此接種多次，直至培養(yǎng)出純化的目標菌落。依據(jù)文獻鑒定。再將分離的病原菌接種到無病的果實上，能夠正常發(fā)病，將病斑按以上相同方法分離、純化，得到相同的病原菌，挑取菌落邊緣菌絲及分生孢子進行顯微鏡觀察、照相。具體方法參照文獻進行。

1.2.2.2 對灰霉菌菌絲生長的抑制毒力測定

采用菌絲生長速率法［5］測定。將抑菌液取10 mL加入到100 mL PDA培養(yǎng)基中混合均勻，制成帶藥培養(yǎng)基，然后取已經(jīng)培養(yǎng)好的表面均勻的菌落以Φ=0.638 cm的打孔器打菌餅，用鑷子夾取倒置接種于帶藥培養(yǎng)基上，每處理重復3次，以不加抑菌液而加入10 mL無菌水于100 mL PDA培養(yǎng)基中為對照，另設不加納他霉素只加對應溶劑為對照以消除溶劑的影響，于培養(yǎng)第7天，分別測定各處理對灰霉菌菌絲生長的抑制作用，用十字交叉法測定菌落直徑，并計算菌絲凈生長量和抑制率，經(jīng)DPS統(tǒng)計軟件分析求出毒力回歸方程及抑制中濃度(EC50)值。

1.2.2.3 葡萄采后貯藏品質的測定

果梗褐變指數(shù)［6］:每次隨機取20穗果進行分級，并按照公式褐變指數(shù)/%=［(各級果穗數(shù)×褐變級數(shù))/(總果穗數(shù)×最高級數(shù))］×100計算。果梗、穗軸部位均沒有褐變?yōu)?級，果?；蛩胼S褐變面積不超過總面積的1/4為1級，果梗或穗軸褐變面積占總面積的1/4－1/2為2級，果梗或穗軸褐變面積占總面積的1/2－3/4為3級，果梗和穗軸褐變面積超過3/4為4級。

果實硬度采用TA.XT.Plus物性測試儀P/2探頭進行穿刺壓縮測定，每個引物隨機取15個果粒。

1.2.2.4 葡萄內在品質的測定

可溶性固形物(TSS)含量用便攜式手持折光儀(pocket refractometer PAL-1)測定，各處理隨機取30個果粒，去皮、打漿后取汁測定，每次測定15個數(shù)值;

可滴定酸(TA)含量采用酸堿滴定法［5］測定，3次重復;

Vc含量采用鉬藍比色法［7］測定，3次重復。

1.2.2.5 代謝生理指標的測定

呼吸強度的測定參考Dharini(2010)的方法［8］。葡萄出庫后，立即從各處理葡萄果穗不同部位剪取小串果穗，精確稱重(約500 g)后放置于容積為2 L的密閉干燥罐中，將罐口密封后統(tǒng)一放置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中4 h。然后以Chcak point型便攜式O2/CO2測定儀測定罐內CO2濃度，并計算呼吸強度，單位為mgCO2/(kg·h)，3 次重復。

丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸比色法測定［9］，3 次重復。

質膜透性采用外滲電導法［10］測定，3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

文中所用數(shù)據(jù)均采用Excel 2003轉化為表格和折線圖，采用DPS7.05統(tǒng)計軟件進行分析及多重比較。

2 結果與分析

2.1 納他霉素對葡萄采后灰霉病菌的抑制毒力的作用

經(jīng)過軟件分析，計算出納他霉素對灰霉菌絲的抑制毒力回歸方程為y=81.883x+14.439，山梨酸鉀對灰霉菌絲的抑制毒力回歸方程為y=6.295 8x+13.752?？梢缘贸觯S著納他霉素和山梨酸鉀抑菌溶液濃度的增加，其對灰霉菌菌絲生長的抑制率逐漸增大，濃度為10 g/L的山梨酸鉀溶液對菌絲的抑制率為67.31%，而濃度為1 g/L的納他霉素的抑制率就已達83.04%。根據(jù)回歸方程計算得出，山梨酸鉀EC50值為5 753.65 mg/L，而納他霉素 EC50值僅為433.96 mg/L，明顯低于山梨酸鉀處理組，這說明納他霉素對灰霉菌的抑制毒力要大于山梨酸鉀，納他霉素可以有效抑制灰霉菌的生長。

2.2 不同采前處理對葡萄采后貯藏品質的影響

2.2.1 對葡萄采后霉爛率的影響

隨著貯藏時間的延長，山梨酸鉀處理組、納他霉素處理組及對照組的葡萄果實均出現(xiàn)不同程度的霉爛現(xiàn)象(圖1)，其中山梨酸鉀處理組與對照組霉爛率變化趨勢較為接近，二者都在貯藏40 d時霉爛率大幅增加，并在貯藏80 d后幾乎達到同一水平;而納他霉素處理組則在貯藏60 d時才出現(xiàn)明顯霉爛現(xiàn)象，并且霉爛率增長相對緩慢，貯藏80 d時的腐爛率僅為39.6%，遠低于對照組的79.7%，可見對于霉菌的抑制效果，納他霉素要比山梨酸鉀更為明顯。

圖1 不同處理對葡萄采后霉爛率的影響Fig.1 The impact of different treatments on the rotten rate of grapes postharvest

2.2.2 不同處理對葡萄采后果梗褐變指數(shù)的影響

在果梗褐變方面，處理組與對照組的果梗褐變指數(shù)均隨貯藏時間的延長而增加(圖2)，山梨酸鉀處理組與對照組的變化趨勢幾乎一致，貯藏80 d時果梗褐變指數(shù)已達14%左右，而納他霉素處理組在各個時期的果梗褐變指數(shù)都比另兩組低的多，增長幅度緩慢，80 d時也僅為6.9%，可以看出納他霉素對葡萄果梗的褐變抑制效果較好，而山梨酸鉀在抑制褐變方面效果較差。

圖2 不同處理對葡萄采后果梗褐變指數(shù)的影響Fig.2 The impact of different treatments on the stems browning index of grapes postharvest

2.2.3 不同處理對葡萄采后失重率的影響

葡萄果實屬于多汁的水果，因此葡萄果實的在貯藏期間易失去水分而失重，致使感官指標有所下降。經(jīng)過一段時間的貯藏后兩種處理的葡萄果實與對照組相比較失重率均有所增加(圖3)，但增加幅度較對照組緩慢，貯藏至60 d時三者失重率仍然接近，80 d時對照組葡萄的失重率明顯升高，達2.09%，并且山梨酸鉀處理組的果實失重率(1.01%)略高于納他霉素處理組(0.81%)，可見納他霉素與山梨酸鉀對降低葡萄果實失重率的作用較一致。

圖3 不同處理對葡萄采后失重率的影響Fig.3 The impact of different treatments on the weight loss rate of grapes postharvest

2.2.4 不同處理對葡萄采后硬度的影響

葡萄果實的硬度也是衡量口感和外觀的一個重要因素，不論是處理組還是對照組，果實硬度都隨貯藏時間的延長而降低(圖4)，并且三者差距不大。80 d時納他霉素處理組、山梨酸鉀處理組和對照組的果實硬度分別為3.09、2.85及2.18 N，處理組的果實硬度只是在貯藏后期略高于對照組，即納他霉素與山梨酸鉀均未有效改善葡萄果實的硬度。

2.3 不同處理對葡萄采后品質生理指標的影響

2.3.1 不同處理對葡萄采后可溶固形物含量的影響

由圖5可溶固形物的結果可以看出，山梨酸鉀處理組和對照組的果實可溶固形物含量隨時間延長均出現(xiàn)下降現(xiàn)象，納他霉素處理組的葡萄果實隨貯藏時間的延長其含量無明顯變化，并始終與采摘初期含量(17.27%)相近。山梨酸鉀處理組在貯藏80 d后含量才出現(xiàn)下降(15.5%)，對照組則是貯藏60 d時含量明顯下降，80 d時低至13.1%。即在較短貯藏期內(0－40 d)不論是否加入防腐劑對葡萄果實中可溶固形物的含量變化都無太大影響。

圖4 不同處理對葡萄采后硬度的影響Fig.4 The impact of different treatments on the hardness of grapes postharvest

圖5 不同處理對葡萄采后可溶固形物含量的影響Fig.5 The impact of different treatments on the content of soluble solids of grapes postharvest

2.3.2 不同處理對葡萄采后可滴定酸含量的影響

可滴定酸與還原糖形成的糖酸比是影響果實風味的重要指標，對可滴定酸的測定中，納他霉素處理組的含量在貯藏期內無明顯變化(圖6)，而山梨酸鉀處理組與對照組總體呈下降趨勢。山梨酸鉀處理組在貯藏20 d時可滴定酸含量出現(xiàn)短暫上升，達到0.53%，之后同對照組一樣迅速下降，至80 d時已無明顯差異?？梢娂{他霉素處理可以明顯延緩葡萄果實中可滴定酸含量的降低，而山梨酸鉀處理在貯藏初期會致其酸含量升高，但最終對可滴定酸含量的維持無明顯效果。

2.3.3 不同處理對葡萄采后Vc含量的影響

葡萄是富含Vc的水果，處理組和對照組中的Vc含量均隨貯藏時間的延長而降低(圖7)，在貯藏40 d時對照組果實的Vc含量出現(xiàn)小幅上升，之后下降。三者Vc含量直至貯藏80 d時才出現(xiàn)較為明顯的差異，可見短期貯藏內(0～60 d)納他霉素和山梨酸鉀的加入并未有效保持葡萄中Vc的含量。

圖6 不同處理對葡萄采后可滴定酸含量的影響Fig.6 The impact of different treatments on the content of titratable acid of grapes postharvest

圖7 不同處理對葡萄采后Vc含量的影響Fig.7 The impact of different treatments on the Vitamin C content of grapes postharvest

2.4 不同處理對葡萄采后代謝生理指標的影響

2.4.1 不同處理對葡萄采后呼吸強度的影響

呼吸作用隨貯藏時間延長而增強。果實貯藏狀況與它們的呼吸作用密切相關，降低果實的呼吸作用可以延長保藏期［11］。在生理代謝水平上，納他霉素處理組的果實呼吸強度在貯藏期間總體呈上升趨勢(圖8)，只是在40 d時出現(xiàn)略微下降［1.46 mgCO2/(kg·h)］;而山梨酸鉀處理組在貯藏20 d時出現(xiàn)呼吸高峰2.03 mgCO2/(kg·h)，之后變化趨勢平穩(wěn);對照組的呼吸強度變化波動較大，但最終呈上升趨勢。

2.4.2 不同處理對葡萄采后果梗和果粒質膜透性的影響

從圖9中看出，果梗質膜透性的變化較大，對照組果梗電導率除了在貯藏40 d時明顯下降外，其余時期的變化趨勢與山梨酸鉀處理組相近，最終都呈上升趨勢，并在貯藏80 d后接近一致，達到25%左右。納他霉素處理組的果梗質膜透性則是在貯藏20 d時出現(xiàn)升高而后緩慢下降，到80 d時其電導率仍較低，為9.0%。與果梗不同，三者果粒質膜透性的變化趨勢則較為一致，均隨貯藏時間延長呈升高趨勢，貯藏后期電導率大小順序依次為CK＞山梨酸鉀＞納他霉素?？梢姡{他霉素對保持葡萄果梗細胞膜的完整性方面明顯優(yōu)于山梨酸鉀，但對葡萄果粒細胞膜完整性的保持上作用不大，只是略微好于山梨酸鉀。

圖8 不同處理對葡萄采后呼吸強度的影響Fig.8 The impact of different treatments on the respiratory intensity of grapes postharvest

圖9 不同處理對葡萄采后果梗及果粒質膜透性的影響Fig.9 The impact of different treatments on the membrane permeability in stems and berry of grapes postharvest

2.4.3 不同處理對葡萄采后MDA含量的影響

丙二醛(MDA)的含量測定結果中，納他霉素處理組的變化趨勢仍然較為平穩(wěn)(圖10)，在貯藏后期含量略微降低;山梨酸鉀處理組的含量變化則出現(xiàn)緩慢上升;而對照組則在貯藏20 d時明顯下降，只有3.57 nmol/g，之后迅速上升，至80 d時已達到16.40 nmol/g，高于山梨酸鉀處理組(11.45 nmol/g)和納他霉素處理組(5.95 nmol/g)。由此可見納他霉素很好的抑制了葡萄果實中膜脂的過氧化作用。

圖10 不同處理對葡萄采后MDA含量的影響Fig.10 The impact of different treatments on the MDA content of grapes postharvest

3 討論

3.1 納他霉素對葡萄采后灰霉病菌的抑制毒力的作用

納他霉素作為一種新型高效的天然生物防腐劑，越來越受到人們關注。在本實驗中對灰霉菌抑制毒力的研究可知納他霉素對菌絲生長率的抑制作用要好于山梨酸鉀，二者EC50值分別為5 753.65 mg/L和433.96 mg/L，另有研究也表明，納他霉素對真菌的抑制作用比山梨酸鉀強50倍左右［12］。這是由于納他霉素分子與真菌細胞質膜上的甾醇分子結合，破壞了細胞質膜的滲透性，引起菌內營養(yǎng)物質外滲而死亡，因此納他霉素對酵母和霉菌等真菌有很好的抑制作用，而對細菌則不起作用［13］。孫遠功等［14］采用直接噴霧法將不同濃度的納他霉素懸浮液作用于柑橘并與未處理的柑橘進行比較，發(fā)現(xiàn)溫度為18～22℃、濕度為58%～65%的條件下納他霉素的最佳作用濃度為300～400 mg/L，與本文研究結果類似。Leeuwen等［15］比較了納他霉素與其他抗真菌劑在質膜透性上的區(qū)別及內吞作用的影響，發(fā)現(xiàn)納他霉素的作用方式與其他抗真菌劑不同，它無法透過萌發(fā)的孢子，但在一定劑量和時間下會干擾內吞作用，這也證實了納他霉素對霉菌具有較高的抑制作用。

3.2 納他霉素對葡萄采后灰霉病菌的貯藏品質及生理指標的影響

本實驗研究結果表明，經(jīng)濃度為0.5 g/L的納他霉素溶液采前浸泡的葡萄果實可大大降低霉爛率，并使可溶固形物含量及可滴定酸含量維持在穩(wěn)定水平，同時很好的抑制果梗的褐變，降低Vc的損失，但在減少失重率和維持果實硬度的作用上與山梨酸鉀相當，效果不明顯。納他霉素的加入明顯地抑制了果梗的衰老，這可能是由于果梗為葡萄果穗的生理活躍部位和物質消耗的主要部位［16］，納他霉素可以抑制其生理活性。山梨酸鉀的添加在一定程度上增加了酸味，可能是因為山梨酸鉀屬酸性防腐劑，它的添加可在短期內提高葡萄果實的含酸量。這兩個指標會影響葡萄果實的口感口味，因此納他霉素可較長時間保持葡萄的酸甜口味。而對于Vc的含量，納他霉素與山梨酸鉀均能較好的降低Vc的損失，這一點與柑橘果實中的研究結果一致［14］。

3.3 納他霉素對葡萄采后灰霉病菌的代謝生理指標的影響

納他霉素在代謝生理水平上的保鮮效果較為突出，可使葡萄果實貯藏期間的呼吸強度維持在穩(wěn)定的水平，并能較好的保持果梗及果粒細胞膜完整性、抑制膜脂的氧化作用。果實呼吸速率的變化規(guī)律是葡萄貯藏期間主要生理指標之一，呼吸作用會使得果實有機物質消耗，品質逐漸下降［11］，維持較低水平的呼吸速率可延長保質期。本實驗中，采前0.5 g/L納他霉素浸果處理的果實呼吸強度在貯藏20 d時均出現(xiàn)小幅升高，這可能是由于實驗使用的納他霉素保鮮液為檸檬酸配制，偏酸性，在處理初期及入貯時對果實具有一定的刺激作用，使果實呼吸作用在開始時出現(xiàn)升高。納他霉素的加入對植物組織新陳代謝過程中的細胞膜具有重要作用，細胞膜透性的高低可以代表細胞膜的完整程度和穩(wěn)定性，一定程度上反映了細胞受傷害的情況，因此電導率值越低，細胞膜完整程度越高，保鮮效果就越好。MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量的增加可對膜和細胞造成一定的傷害，其含量的高低可以反映膜脂過氧化程度。研究發(fā)現(xiàn)［17］，一旦細胞膜完整性被破壞，會引起差別透性喪失，電解質及某些小分子有機物大量滲漏，細胞物質交換平衡破壞，表現(xiàn)在電導率值的增加，生理生化代謝也發(fā)生紊亂，從而引起呼吸強度的變化。有研究表明葡萄的質膜透性隨SO2處理劑量的增加和時間的延長而增大，果梗和果肉中的MDA含量增加［18］，可見SO2對細胞膜完整性可能會造成一定程度的傷害。

綜合以上結果可以看出，納他霉素在延長葡萄果實保鮮期方面具有很好的作用，尤其是對霉菌等真菌的抑制效果突出，在感官指標、內在品質以及代謝生理上也具有較好的防腐保鮮作用。選擇合適濃度的納他霉素溶液可使葡萄保鮮效果達到最佳。納他霉素本身無毒、高效、安全等特點也使得它具有廣泛的應用前景。

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