楊德峰 劉志輝 陳一夫 吳 凡 陳 曦 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林 長春 3004)

五味子為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實，是著名的滋補性中藥?；瘜W(xué)研究證明，五味子的主要化學(xué)成分有木脂素，揮發(fā)油和多糖〔1～4〕，其次還有有機酸、脂肪油等。其中木脂素包括五味子素、五味子甲素、五味子乙素等20多種成分〔5～7〕。關(guān)于五味子木脂素的化學(xué)成分及生物活性研究的報道很多，但目前關(guān)于五味子木脂素抗炎作用機制的研究尚未見報道。本課題首次對五味子甲素的抗炎免疫作用從細胞及分子水平進行闡述，以期為進一步開發(fā)五味子甲素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康昆明種小鼠，體重17～22 g，雌雄各半(吉林醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供);地塞米松磷酸鈉注射液(吳中醫(yī)藥公司);小牛血清(杭州四季清);五味子甲素標準品(維克奇生物公司);DMSO(國產(chǎn));3%巰基乙醇酸鈉(實驗室自備);青鏈霉素混合液、IMDM、MTT、PBS、RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒及DNA-Marker(北京鼎國生物技術(shù)有限公司);NO試劑盒(南京建成生物工程研究所);小鼠IL-6、TNF-α檢測試劑盒(RND分裝)。

1.2 單核巨噬細胞制備 取6～8周齡昆明小鼠5只，每只小鼠腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉1 ml，飼養(yǎng)3 d。第3天脫頸處死，75%酒精浸泡5 min后，無菌條件下，倒立小鼠并腹腔注入無血清IMDM培養(yǎng)液5 ml，仰臥平放并輕輕揉腹部2 min，用鑷子稍提起腹腔，并用剪子剪開一個小口，用吸管輕輕吸取細胞懸液，移入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清。用PBS充分洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，棄去上清后顯微鏡下計數(shù)，用IMDM培養(yǎng)液(含10%小牛血清，青鏈霉素混合液)調(diào)整細胞至所需濃度2.5×105，接種于96孔板中，每孔100 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后換液，去除未貼壁細胞備用。

1.3 單核巨噬細胞炎癥模型制備 取一板已培養(yǎng)于96孔板的細胞，換液后加藥，分為四組:A組:陰性對照組(DMSO)，B組:陽性對照組(加地塞米松)，C組:模型對照組〔細菌脂多糖(LPS)單獨刺激組，LPS終濃度為1.1×10－2〕，D 組:五味子甲素組(終濃度分別是 D1:4×10－5mmol/L、D2:4 ×10－6mmol/L、D3:4 ×10－7mmol/L、D4:4 ×10－8mmol/L，4 組各 0.4 μl)，每組為3孔平行，培養(yǎng)24 h。加藥后室溫靜置5 min，加LPS(LPS終濃度為1.1×10－2)。

1.4 五味子甲素對單核巨噬細胞中IL-1β mRNA表達的影響提取單核巨噬細胞總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定OD260和OD280，OD260為 0.774 2;OD280為 0.412 1;OD260/OD280=1.876 7，介于1.8～2.2之間。另取出5 μl總RNA樣品。在1%普通瓊脂糖凝膠圖譜中顯示28 S、18 S和5 S三條帶，并且三條帶清晰，其中28 S和18 S寬度及亮度比例基本符合2∶1(圖1)，表明RNA完整性較好，無明顯降解，適合做進一步的實驗。其余部分放入－86℃保存。從GenBank中檢出小鼠IL-1β基因cDNA序列(IL-1β:基因編號NM008361，cDNA大小為1 328 bp)。選用看家基因 β-actin作為內(nèi)參照(β-actin:基因編號NM007393，cDNA大小為1 891 bp)。IL-1β的上游引物為5’-ctgaaagctctccacctc-3’，下游引物為5’-tgctgatgtaccagttgggg-3’。βactin的上游引物為5’-gttaccaactgggacgaca-3’，下游引物為5’-aagcctcagggcatcg-3’。按照RT-PCR試劑盒要求進行擴增。擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，以IL-1β與β-actin灰度值的比值分析IL-1β mRNA的表達量。

1.5 五味子甲素提取物對單核巨噬細胞中IL-6、TNF-α、NO含量的影響 取細胞，加藥及分組同1.3。37℃孵育24 h，收集上清，分別嚴格按照小鼠IL-6、TNF-α及NO定量酶聯(lián)檢測試劑盒使用說明操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 五味子甲素對小鼠單核巨噬細胞中IL-1β mRNA表達的影響 RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見清晰的特異性擴增條帶(圖2)，與目的基因片段IL-1β(294 bp)大小相符。五味子甲素組單核巨噬細胞中IL-1β mRNA表達水平(0.327±0.122)明顯低于模型對照組(1.025±0.042)，陽性對照組單核巨噬細胞中IL-1β mRNA表達水平(0.640±0.019)也明顯低于模型對照組，并且五味子甲素組單核巨噬中IL-1β mRNA表達明顯低于陽性對照組。

2.2 五味子甲素對單核巨噬細胞中IL-6、TNF-α、NO含量的影響 與模型對照組及空白對照組比較，五味子甲素可明顯減少單核巨噬細胞炎癥模型上清液中TNF-α、IL-6、NO含量，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 五味子甲素對單核巨噬細胞TNF-α、IL-6、NO含量的影響(s，n=5，mmol/L)

表1 五味子甲素對單核巨噬細胞TNF-α、IL-6、NO含量的影響(s，n=5，mmol/L)

與A組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 TNF-α 0.042 6±0.000 7 0.072 6±0.000 7 0.530±0.003 B組 0.025 2±0.000 52) 0.045 2±0.000 52) 0.262±0.0032)C組 0.041 9±0.000 5 0.071 9±0.000 5 0.512±0.004 D1組 0.021 6±0.000 32) 0.036 6±0.000 32) 0.211±0.0052)D2組 0.024 6±0.000 22) 0.038 6±0.000 22) 0.240±0.0032)D3組 0.037 2±0.000 21) 0.067 2±0.000 21) 0.402±0.0061)組D4 0.038 5±0.000 21) 0.068 5±0.000 21) 0.461±0.0041)IL-6 NO A組

3 討論

IL-1β是一類單核細胞因子，具有很高的活性，從細胞中釋放出來后表現(xiàn)為全身性激素樣介質(zhì)，在1 ng/L濃度時即可表現(xiàn)出非常強的生物學(xué)活性。IL-1β不僅能促進白細胞的聚集，還能直接誘發(fā)其他促炎因子的生成，并激活中性粒細胞，使之參與炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果說明，五味子甲素能有效抑制單核巨噬細胞中IL-1β mRNA的表達，提示抑制IL-1β分泌是五味子甲素發(fā)揮其抗炎作用機制之一。

細胞因子是由某些活化的免疫細胞和基質(zhì)細胞分泌介導(dǎo)、調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)的一類小分子多肽，其中IL-6和TNF-α是最具有影響的介質(zhì)，可以作為炎癥恢復(fù)的判斷指標，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。其中IL-6具有廣泛生物活性的細胞因子，在生物體內(nèi)可以促進活化的B細胞進一步分化為漿細胞并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體(IgG，IgA和IgM)，在機體急性應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，被認為在多種炎癥性疾病的病理生理過程中均發(fā)揮關(guān)鍵性作用;IL-6還可作用于多個靶細胞，通過調(diào)控成熟的炎性細胞作用成分，激活炎性細胞對炎性介質(zhì)的效應(yīng)，其作用的機制可能與IL-6改變細胞內(nèi)G蛋白活性并參與中性粒細胞作用上調(diào)有關(guān)〔8〕。TNF-α是炎癥反應(yīng)早期最重要細胞因子之一，是一種由活化的單核-巨噬細胞分泌的促炎癥因子，具有活化內(nèi)皮細胞、中性粒細胞等作用，是導(dǎo)致炎性介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子。在炎癥過程中TNF-α在局部組織中出現(xiàn)較早，并迅速達到高峰，從而誘發(fā)“次級”細胞因子如IL-6、IL-1β等的生成，是激活細胞因子級聯(lián)反應(yīng)主要介質(zhì)，增強中性粒細胞的吞噬活性，合成和釋放IL-6、IL-1、IL-8等;改變血管內(nèi)皮細胞骨架，破壞完整性，導(dǎo)致毛細血管通透性增強，中性粒細胞合成和釋放TNF，后者反過來促進中性粒細胞聚集，并激活中性粒細胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，他們互相影響，互相作用，加重組織炎癥和損傷〔9〕。它還參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)與放大，是炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)之間橋梁介質(zhì)。

NO具有細胞內(nèi)和細胞間信使以及神經(jīng)遞質(zhì)作用的信息分子，參與很多病理和生理的過程。在很多組織中，盡管其真正釋放量目前很難檢測，但已確知會釋放出不同濃度NO，并且濃度變化與機體生理機能密切關(guān)聯(lián)。而過多NO通常伴隨免疫紊亂和炎癥，神經(jīng)疾病，動脈粥樣硬化，疼痛和癌癥等〔10〕。NO的生物合成是在一氧化氮合酶(NOS)催化和輔助因子存在下由L-精氨酸與氧分子反應(yīng)而來。誘導(dǎo)型NOS(iNOS)在靜息細胞內(nèi)不表達，當細胞受到細胞因子、其他微生物或免疫刺激下，iNOS表達才能增加并產(chǎn)生大量NO引起炎癥反應(yīng)〔11〕。NO是一種重要免疫分子和炎癥介質(zhì)，在炎癥發(fā)展中具有雙重作用，一方面通過刺激巨噬細胞誘導(dǎo)受感染細胞死亡和炎癥，起到對抗外源性微生物的細胞毒作用，另一方通過促進周邊非損傷細胞毒性或細胞炎癥，加劇膿毒癥，自身免疫或超敏反應(yīng)的組織損傷〔12〕。本研究首次從分子水平證實了五味子甲素可影響單核細胞巨細胞中細胞因子IL-6，TNF-α，NO的表達，且具有劑量依賴性。

綜上結(jié)果，推測五味子甲素可能通過抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、NO表達等多種途徑控制炎癥，發(fā)揮其抗炎的作用，為進一步開發(fā)五味子甲素這種抗炎中藥制劑提供理論依據(jù)。

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