于立博 劉繼文 (新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊 830011)

金屬硫蛋白(MT)存在于除結締組織外的所有真核生物中，是一種分子量較小(6 000～7 000 D)、富含半胱氨酸的非酶蛋白質〔1〕。MT具有強的抗氧化、重金屬解毒等特性。由于其廣泛的生理功能，自上世紀50年代被發(fā)現以來MT就成為生物化學及生命科學領域的研究熱點。有研究顯示，外源性的金屬硫蛋白能夠拮抗鉛毒性〔2〕，但是MT拮抗鉛毒性的機制還不是十分清楚。本實驗利用從植物中提取的MT對染鉛小鼠的骨髓間充質干細胞進行干預，探討MT拮抗鉛毒性的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 鷹嘴豆由新疆木壘縣大龍王食品有限公司提供。

1.2 儀器及試劑 Cintra 10e型Uu-Visible Spectrometer(紫外掃描儀，美國)，HITACHI 20Pr-52D型低溫冷凍離心機，日立Z-7000型偏振塞曼原子吸收分光光度計，血紅蛋白(Sigma公司產品)，CdCl22.5H2O(分析純，西安化學試劑廠)，pH=8.6Tris-Cl(Sigma公司產品)，95%乙醇(分析純，西安化學試劑廠)。酶聯免疫檢測儀，流式細胞儀(FCM，Flow cytometry)，1640培養(yǎng)基(Gibco Life公司)，96孔板，Mtt試劑盒與凋亡試劑盒均購于南京建成生物公司。

1.3 樣品處理及類MT的提取 將鷹嘴豆籽粒在液氮存在下碾碎后過80目篩，稱取樣品粉末 1.0 g，加入 10倍體積0.1 mol/L pH8.6的Tris-HCl緩沖液后于4℃冰箱過夜抽提。抽提液于4℃下，12 000 r/min離心30 min，收集上清液。上清液于100℃水浴加熱1 min，迅速冷卻。再于4℃ 10 000 r/min離心20 min，收集上清液，加入3倍體積的－20℃的預冷無水乙醇，－20℃過夜。過夜沉淀后，于4℃ 12 000 r/min離心20 min。取沉淀加入5 ml 0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液溶解數小時，所得溶液即無細胞類MT提取液。取以上類MT提取液裝入透析袋中，在聚乙二醇-600(PEG-600)中透析濃縮。濃縮液經高效液相柱層析，離子交換層析脫鹽后收集純化MT分離液。收集的分離液于低溫進行冷凍干燥制成凍干粉待用。

1.4 小鼠骨髓干細胞的培養(yǎng) 取同窩出生3 d的昆明種小鼠兩只，斷頸處死后用75%酒精消毒處理，后剪開皮膚并取下股骨。超凈臺中，于培養(yǎng)皿中剝去小鼠股骨周圍筋膜及肌肉，用PBS洗3～5遍，用5 ml注射器吸取無血清培養(yǎng)液后將針頭扎入骨髓中將骨髓吹出，吹出的骨髓置于離心管中，于常溫下1 000 r/min離心5 min。離心后棄去上清液，于沉淀中加入含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基吹打混勻后移入培養(yǎng)瓶中，于37℃CO2孵育箱中進行培養(yǎng)，2～3 d換液1次。熒光顯微鏡下觀察，待細胞增殖穩(wěn)定融合達到80%以上時，將細胞轉移至6孔板進行培養(yǎng)，即進行干預實驗。

1.5 受試物劑量及分組 通過MTT預實驗測得鉛的細胞半數致死劑量IC50=200 μg/L，取其1/5作為細胞染毒的劑量即0.04 μg/ml。取以上MT凍干粉溶于細胞培養(yǎng)基中配成終濃度為 0.01，0.005，0.001，0.000 5、0.000 1 g/ml 5 個濃度組，空白對照組(含同一細胞密度的培養(yǎng)液)和本底對照組(等體積含相應濃度MT的無細胞培養(yǎng)液)及標準對照組(含同一細胞密度的標準MT培養(yǎng)液)。每孔中加入100 μl醋酸鉛溶液同時分別加入同體積的相應濃度的MT溶液，分別于24、48和72 h觀察細胞活力及凋亡情況。最后在酶聯免疫吸附法檢測儀上測定490 nm波長各孔光吸收值A490，記錄結果。計算生長抑制率(按以下公式)。細胞生長抑制率=(空白對照組A均值－實驗組A均值)/空白對照組A均值×100%。實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 細胞活力的測定結果 對染毒24 h細胞，受試物0.001、0.05、0.01 g/ml濃度組的A值低于空白對照組(P＜0.05);對染毒48 h細胞，受試物0.001、0.05、0.01 g/ml濃度組A值均低于空白對照組，而0.000 1與0.000 5 g/ml濃度組A值與空白對照組比較無差異(P＞0.05);對染毒72 h細胞，受試物0.005、0.001、0.05、0.01 g/ml濃度組 A值低于空白對照組(P＜0.05)，只有0.000 1 g/ml濃度組A值與空白對照組比較無差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 MT對細胞凋亡的影響 用AV(AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶(PI)雙染24，48，72 h細胞，用0.01和0.05 g/ml MT干預作用24 h后，3個時間細胞的凋亡率均明顯高于空白對照組(P＜0.01)，其中干預效果最好是24 h、0.01 g/ml組，凋亡率為11.60%。見表2、圖1。

表1 MT對細胞活力的影響(s)

表1 MT對細胞活力的影響(s)

與空白對照組比較:1)P＜0.05，下表同

組別 A值抑制率(%)24 h 48 h 72 h空白對照組24 h 48 h 72 h 0.445±0.038 0.376±0.019 23.34 3.68 5.05 0.407±0.018 0.462±0.025 0.396±0.041 － － －0.01 g/ml組 0.154±0.0251) 0.148±0.0101) 0.196±0.0231) 62.16 67.97 50.50 0.005 g/ml組 0.201±0.0111) 0.265±0.0181) 0.211±0.0251) 50.61 42.64 46.72 0.001 g/ml組 0.253±0.0281) 0.352±0.0631) 0.256±0.0251) 38.57 23.80 35.36 0.000 5 g/ml組 0.300±0.0581) 0.420±0.047 0.350±0.016 24.29 9.13 11.62 0.000 1 g/ml組 0.312±0.0211)

圖1 24、48、72 h染鉛細胞凋亡的流式細胞術分析

表2 MT對染鉛細胞凋亡的影響( s，%)

表2 MT對染鉛細胞凋亡的影響( s，%)

0.10±0.31 0.70±0.01 2.40±0.11 0.01 g/ml組 11.60±1.311) 12.50±1.21 20.06±1.241)0.005 g/ml組 22.70±1.231) 21.70±1.151) 28.60±1.451)24 h 48 h 72 h空白對照組組別

3 討論

鉛是一種重金屬，在人體沒有任何生理作用并且具有細胞毒性，鉛進入細胞后會引起細胞發(fā)生氧化應激反應，破壞線粒體使細胞膜的通透性增加，最后導致細胞崩解死亡〔3〕。目前臨床上治療鉛中毒大多是采用巰基絡合物，絡合物進入體內后可結合重金屬，但是同時會產生副作用，干擾體內其他礦物質的代謝。MT是一種存在于正常人體中的小分子蛋白質，含有大量巰基，具有強的與重金屬離子鉛結合的特性，具有捕獲自由基，抗氧化應激抗凋亡的作用〔4〕。因此當外源性MT存在時就可以和細胞內的重金屬鉛離子結合，從而減輕鉛對細胞的毒性作用，本研究結果提示外源性植物MT確實能夠拮抗鉛的細胞毒性，增強細胞活力，但是具體機制有待進一步研究。

1 Kagi JHR.Metallothionein proceeding of the first international meeting etallothein and other molecular weight metal bring protein〔J〕.Experientia，1979;12(3):17.

2 茹柄根.金屬硫蛋白〔J〕.生物化學與生物物理進展，1991;18(4);254-89.

3 Thonalley P，Vasak M.Possible role for metallthionein in protection against radiation-induced oxidative stress kinetics and mechanism of reaction with superoxide and hydroxyl radicals〔J〕.Biophy Acta，1985;827:36-44.

4 于 東，丁世彬，廖 丹，等.金屬硫蛋白排鉛和肝臟保護作用的實驗研究〔J〕.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2012;38(3);150-3.