孫 昊，郝再彬

(桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，中國(guó) 桂林 541004)

茶葉中富含多酚類(lèi)物質(zhì)，統(tǒng)稱(chēng)為“茶多酚”，其主要成分為4種兒茶素類(lèi)化合物，占茶葉干重的5%～20%.大量的研究表明[1-3]，兒茶素有很好的抑菌效果：抗菌譜廣，對(duì)有細(xì)胞壁和無(wú)細(xì)胞壁的革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌均有明顯的抑制作用；抗菌作用強(qiáng)，用藥濃度低；在體內(nèi)外均有抗菌及抗細(xì)菌毒素的作用；保護(hù)和促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)菌群平衡；不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[4]．本文主要研究?jī)翰杷刭|(zhì)量濃度、pH 值和溫度對(duì)兒茶素抑菌活性的影響，以期為兒茶素應(yīng)用于天然食品防腐劑奠定基礎(chǔ)[5]．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82%的兒茶素(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)、無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氯化鈉、鐵氰化鉀K3Fe(CN)6、二苯基苦基苯肼(DPPH)、磷酸氫二鈉、檸檬酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸，以上試劑均為分析純．

1.2 儀器設(shè)備

TU-1800S 紫外分光光度計(jì)(美國(guó)VARIAN公司)；BS110S (塞多利斯)電子天平(北京塞多利斯有限公司)；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海-恒科技有限公司)；RE-52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品) ；LRH-150-Z振蕩培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)；LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)．

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC法測(cè)定兒茶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[6-11]測(cè)定條件：C18反相柱(Dikma, C18, 5 μm, 150×4.6 mm)，流動(dòng)相為V水∶V甲醇∶V乙酸=74∶25∶1，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，流動(dòng)相速度1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃．

1.3.2 茶多酚中兒茶素的抑菌效果研究[12]

(1) 平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定茶多酚最低抑菌濃度的結(jié)果 在已滅菌并裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中注入10-7的菌懸液0.2 mL，涂布均勻后晾干．在相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿中，加不同濃度的兒茶素溶液(1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0和2.2 g/L)1.0 mL，以無(wú)菌水作空白對(duì)照，涂布均勻后晾干．晾干后，倒置于30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)．

(2) 濾紙圓片法[13]研究不同質(zhì)量濃度和pH值的茶多酚抑菌效果 配制1～8 g/L的茶多酚溶液，分別取10 mL各種質(zhì)量濃度的茶多酚溶液和10 mL無(wú)菌水，把濾紙圓片浸泡其中，0.5 h后使用．配制出pH值為4、5、6、7、8、9和10的5 g/L茶多酚溶液．把已滅菌的直徑為5.8 mm的濾紙圓片浸泡在5 g/L茶多酚溶液中，浸泡0.5 h后使用．無(wú)菌水作空白對(duì)照，取OD值為0.8的菌懸液0.05 mL，倒入融化并冷卻至45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(約15 mL/平皿)中．取浸泡在兒茶素溶液的濾紙圓片，按正三角形排列在倒有培養(yǎng)基的平皿表面．作好標(biāo)記后，倒置放于30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h．24 h后觀察并測(cè)出其抑菌圈直徑．

(3) 茶多酚中兒茶素氧化前后抑菌效果的研究[14]配制質(zhì)量濃度均為25 g/L的NaHCO3、茶多酚和K3Fe(CN)6溶液．將NaHCO3溶液加入K3Fe(CN)6溶液中攪勻后，再加入茶多酚溶液中攪勻．25 ℃水浴15 min，pH分別調(diào)至3.0、7.0、10.0之后用乙酸乙酯分別萃取(每次20 mL，3×3次合計(jì)9次)，分別得氧化組分酸性EOFB，簡(jiǎn)稱(chēng)B；中性EOFA，簡(jiǎn)稱(chēng)A；堿性EOFC，簡(jiǎn)稱(chēng)C．分別在35 ℃下將溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的濃縮液在30 ℃的真空干燥箱中干燥，干燥后取出，置于4 ℃的冰箱中保存以備用．

氧化后茶多酚的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 mg的A和B樣品分別溶于4 mL的無(wú)菌水中，濾紙圓片浸泡其中0.5 h．取5 g/L的茶多酚溶液4 mL，濾紙圓片浸泡其中0.5 h．

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC法測(cè)定兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果

按1.3.1方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和采購(gòu)的茶多酚樣品(見(jiàn)圖1～2)，各3次，計(jì)算出各種兒茶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(表1)．EGCG占總量的55.5%，最高；C為3.52%，最低．

表1 HPLC法檢測(cè)采購(gòu)的茶多酚樣品中各種兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Tab.1 Content of catechins from tea polyphenols sample by HPLC

物理量ECCEGCGECGEGC茶多酚出峰時(shí)間/min5.56.07.510.016.0—質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%9.223.5255.5213.0118.73100.00

2.2 茶多酚中兒茶素的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

茶多酚對(duì)4種菌均有抑制作用，且隨著茶多酚質(zhì)量濃度增加抑菌效果呈上升趨勢(shì)．當(dāng)茶多酚為1.0 g/L左右時(shí)，基本達(dá)到了50%抑菌效果；2.0 g/L時(shí)，培養(yǎng)皿中無(wú)菌落生長(zhǎng)，抑菌效果達(dá)到100%(表2)．

用濾紙圓片法考察了不同質(zhì)量濃度茶多酚溶液的抑菌效果(圖3，空白直徑5.80 mm，圖中各個(gè)數(shù)據(jù)為減去空白直徑后的數(shù)值，下同)．可以看出不同質(zhì)量濃度的茶多酚溶液對(duì)4種菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，且抑菌圈直徑圖形走勢(shì)大致呈拋物線(xiàn)型，在茶多酚達(dá)到5 g/L時(shí)都存在明顯的拐點(diǎn)，當(dāng)茶多酚大于5 g/L時(shí)，曲線(xiàn)走勢(shì)平緩，抑菌效果基本不變．

表2 不同質(zhì)量濃度的茶多酚對(duì)幾種菌生長(zhǎng)的影響(菌落數(shù)調(diào)查)

圖3 含有不同質(zhì)量濃度的茶多酚濾紙片的抑菌效果Fig.3 Bacteria growth in different concentrations of tea polyphenols

用濾紙圓片法考察了不同pH值的茶多酚溶液的抑菌效果．圖4表明，不同pH值的茶多酚溶液對(duì)4種菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，當(dāng)茶多酚溶液pH為3～8時(shí)，茶多酚對(duì)4種菌都有一定的抑菌效果，但當(dāng)pH低于2或者大于9時(shí)，茶多酚的抑菌效果較差，且抑菌圈直徑圖形走勢(shì)呈典型拋物線(xiàn)型，在pH為5左右時(shí)曲線(xiàn)有最大值出現(xiàn)．因此茶多酚溶液在pH 4～6時(shí)有最佳抑菌效果.

圖4 茶多酚溶液的pH值對(duì)菌的生長(zhǎng)影響Fig.4 Bacteria growth in different pH values of tea polyphenols

茶多酚氧化前，酸性氧化組分EOFB和中性氧化組分EOFA對(duì)4種菌均有抑菌效果(表3)．茶多酚在氧化前最為明顯，對(duì)4種菌的抑菌效果在10.0～10.5之間；但是一旦被氧化其抑菌效果下降顯著，其中中性氧化組分EOFB抑菌效果較好，堿性氧化組分EOFC基本無(wú)抑菌作用．

表3 茶多酚氧化前后的抑菌效果(抑菌圈直徑mm)

3 討論

通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)表明茶多酚中的兒茶素對(duì)于草生歐文氏桿菌、枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌以及大腸桿菌均有較明顯的抑菌效果，得到最低抑菌濃度為2 g/L，最佳抑菌濃度為5 g/L．兒茶素在強(qiáng)酸及強(qiáng)堿性條件下極不穩(wěn)定，其分子結(jié)構(gòu)中存在的酚性羥基被氧化而喪失其抑菌活性，而當(dāng)pH在4～6時(shí)，茶多酚抑菌效果最佳．觀察氧化前后的抑菌效果可以發(fā)現(xiàn)，兒茶素氧化前抑菌圈直徑遠(yuǎn)大于氧化后的直徑，說(shuō)明其抑菌活性主要存在于氧化前．

參考文獻(xiàn)：

[1] FUJII Y， ARIMURA Y， WAKU M，etal. More evidence links green tea to heart health[J]. Mayo Clin Health Lett, 2008,26(12):4-6.

[2] NAITO Y, YOSHIKAWA T. Green tea and heart health[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2009,54(5):385-390.

[3] 王 利,翟金蘭,楊 婷,等.茶多酚的應(yīng)用及提取方法[J].食品研究與開(kāi)發(fā), 2006,27(3):154-156.

[4] 梁文紅.茶多酚抗菌作用的研究概況[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè), 2004,31(4):26-28.

[5] 唐裕芳, 張妙玲, 馮 波,等.茶多酚的抑菌活性研究[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào), 2005,22 (5):553-557.

[6] LI L, ZHANG J L, SHENG Y X,etal. Simultaneous quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by high-performance liquid chromatography-UV method[J]. J Pharmaceut Biomed, 2005,38(1):45-51.

[7] LAU A J, WOO S O, KOH H L,etal. Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection[J]. J Chromatogr A, 2003,1011 (1):77-87.

[8] WAN J B, LAI C M, LI S P,etal. Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction[J]. J Pharmaceut Biomed, 2006,41(1):274-279.

[9] SHANGGUAN D H, HAN H W, ZHAO R,etal. New method for high-performance liquid chromatographic separation and fluorescence detection of ginsenosides[J]. J Chromatogr A, 2001,910(2):367-372.

[10] CUI J F, BJORKHEM I, ENEROTH P. Gas chromatographic-mass spectrometric determination of 20 (S)-protopanaxadiol and 20(S)-protopanaxatriol for study on human urinary excretion of ginsenosides after ingestion of ginseng preparations[J]. J Chromatogr B, 1997,689(2):349-355.

[11] LAU A J, SEO B H, WOO S O,etal. High-performance liquid chromatographic method with quantitative comparisons of whole chromatograms of raw and steamed Panax notoginseng[J]. J Chromatogr A, 2004,1057(1-2):141-149.

[12] 衛(wèi)生部衛(wèi)生執(zhí)法與監(jiān)督司.消毒技術(shù)規(guī)范[M].北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2002:83-93.

[13] 錢(qián)存柔. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 1999.

[14] 劉丹丹,郝再彬,李海云,等.茶多酚對(duì)草生歐文氏桿菌抑菌功效的研究[J].植物保護(hù), 2009,35(6):78-82.