朱路平 趙宜紅 孫 曼 楊景華 周 甜 趙新年 張雁冰 李寅超

(1河南省疾病預(yù)防控制中心，鄭州，450003;2鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州，450001;3河南省新四方制藥有限公司，周口，466000)

阿膠補(bǔ)血軟膠囊是河南省新四方制藥有限公司在已上市的阿膠補(bǔ)血膏原劑型基礎(chǔ)上的改進(jìn)制劑，由阿膠、熟地黃、黃芪、黨參、枸杞子等6味藥組成［1］，具有益氣補(bǔ)血之功效，用于久病體弱，氣虛血虧。為了明確新劑型的有效性和與阿膠補(bǔ)血膏的等效性，我們對阿膠補(bǔ)血軟膠囊的小鼠急性毒性及耐缺氧作用進(jìn)行了初步的實驗研究［2］。本實驗進(jìn)一步觀察阿膠補(bǔ)血軟膠囊對小鼠失血性貧血的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品 阿膠補(bǔ)血軟膠囊，紅褐色粉末，由河南省新四方制藥有限公司提供，批號20110318，規(guī)格:每1 g相當(dāng)于生藥4.26 g，擬臨床劑量為0.061 3 g·kg－1，4℃冰箱密封保存;復(fù)方阿膠漿(陽性對照藥);阿膠補(bǔ)血膏(原劑型對照藥)，由河南省新四方制藥有限公司提供，批號20110215;生理鹽水(N.S)，河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號11081021。

1.2 動物 昆明種小鼠(雌雄各半)SPF級，體質(zhì)量(20±2)g，河南省動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2010－0002，動物質(zhì)量合格證號:0000877;飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)藥學(xué)院實驗動物房IVC設(shè)備，使用許可證號:SYXK(豫)2007－0009。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后供試驗用。

1.3 試劑 EPO試劑盒(美國 R＆D公司，批號:201108);蒸餾水(自制);XFA6030型全自動動物血液細(xì)胞分析儀(南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司);TG16－W型微量高速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);DJ－5000C型電子天平(中外合資亞太電子天平廠);AR1140型分析天平(梅特勒－托利多儀器上海有限公司);CDG3022A型酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(國營華東電子管廠)［3］。

1.4 模型的制作 對照組及各給藥組小鼠，自造模之日起隔日由眼底后靜脈叢放血0.15 mL·10g－1;同時改變其正常飲食量，飼料控制在每日75 g·kg－1體重［4］，自由飲水，連續(xù) 7 d。

1.5 動物分組及給藥 實驗分為陰性對照組、模型對照組、復(fù)方阿膠漿組、阿膠補(bǔ)血膏組、阿膠補(bǔ)血軟膠囊0.55、1.10、2.21 g·kg－1劑量組，12 只/組，雌雄各半。各給藥組于造模前7d給相應(yīng)藥物，給藥體積20 mL·kg－1，每日1次，連續(xù)灌胃至造模第8天(即給藥第15天)。模型對照組和陰性對照組給予等體積生理鹽水。

1.6 小鼠外周血象的測定 在造模第0、4、7 d每只小鼠尾靜脈取血20 μL，檢測外周血RBC數(shù)和Hb濃度。

1.7 小鼠負(fù)重游泳時間測定［5］采用50 cm×40 cm×60 cm塑料水槽，水深約25 cm，水溫(20±0.5)℃。末次給藥40 min后，置小鼠在水槽中游泳，鼠尾根部負(fù)荷約10%體質(zhì)量［4］的鉛絲團(tuán)。實驗時每個水槽每次放入陰性對照組、模型對照組、復(fù)方阿膠漿組、阿膠補(bǔ)血膏組、阿膠補(bǔ)血軟膠囊 0.55、1.10、2.21 g·kg－1劑量組小鼠各1只，并做好標(biāo)記，用秒表計時，記錄小鼠頭部沒于水面下5 s不能上浮的時間，作為小鼠游泳時間(min)。

1.8 小鼠血清EPO的測定 于小鼠造模后第8天負(fù)重游泳后，置籠中擦干休息5 min后摘眼球取血，制備血清，按 ELISA 法測 EPO 含量［6－7］。

2 結(jié)果

2.1 對失血性貧血小鼠外周血RBC的影響 模型對照組小鼠外周血中RBC總數(shù)自造模之日起至造模結(jié)束，均顯著低于陰性對照組(P＜0.01)。阿膠補(bǔ)血軟膠囊各劑量組在給藥14 d(造模第7天)時外周血RBC數(shù)與模型對照組比均有明顯升高，其中0.55 g·kg－1劑量組顯著升高(P＜0.05)，與阿膠補(bǔ)血膏效果接近。見表1。

表1 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對失血性貧血小鼠外周血RBC的影響(±s，n=12)

表1 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對失血性貧血小鼠外周血RBC的影響(±s，n=12)

注:與模型對照組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;表中數(shù)據(jù)下標(biāo)為當(dāng)日動物存活只數(shù)(以下同)。

0 d 4 d 7 d陰性對照 等體積N.S 7.60±0.43 7.35±0.67＊＊ 7.68±0.44組別 劑量/g·kg－1 造模開始各時間點RBC總數(shù)/×1012·L－1＊＊模型對照 等體積N.S 7.66±0.48 5.66±0.56 5.90±0.51(10)復(fù)方阿膠漿 18mL·kg－1 7.95±0.57 5.97±0.92 6.74±0.41(11)＊＊阿膠補(bǔ)血膏 12 7.95±0.39 6.06±0.42 6.63±0.62＊＊阿膠補(bǔ)血軟膠囊 2.21 7.81±0.74 5.89±0.78 6.17±0.55(10)阿膠補(bǔ)血軟膠囊 1.10 7.77±0.50 5.61±1.03 6.19±0.41(11)阿膠補(bǔ)血軟膠囊 0.55 7.63±0.74 5.98±0.74 6.54±0.50(11)*

2.2 對失血性貧血小鼠外周血Hb的影響 與陰性對照組相比，模型對照組小鼠外周血中Hb含量自造模之日起至造模結(jié)束均顯著降低(P＜0.01)。阿膠補(bǔ)血軟膠囊給藥11 d(造模第4天)時2.21，1.10，0.55 g·kg－1劑量組 Hb含量顯著高于模型對照組(P＜0.05)，給藥14 d 時1.10，0.55 g·kg－1劑量組顯著高于模型對照組(P＜0.05，P＜0.01)，與阿膠補(bǔ)血膏效果相當(dāng)?？梢姲⒛z補(bǔ)血軟膠囊可升高外周血中Hb含量，減輕放血法所致外周血象的下降趨勢。見表2。

表2 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對失血性貧血小鼠外周血Hb的影響(±s，n=12)

表2 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對失血性貧血小鼠外周血Hb的影響(±s，n=12)

注:與4 d模型組比較，*P ＜0.05;與7 d模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與4 d、7 d陰性對照組比較，▲▲P ＜0.01。

N.S 136.25±7.25 127.58±9.54 132.17±6.87模型對照 等體積N.S 137.00±8.56 90.33±10.69▲▲ 101.90±9.11▲▲(10)復(fù)方阿膠漿 18mL·kg－1 141.58±14.92 99.58±16.04* 118.82±9.12(11)阿膠補(bǔ)血膏 12 137.50±7.60 102.42±7.12* 118.58±9.62阿膠補(bǔ)血軟膠囊 2.21 139.50±13.94 101.42±12.91* 108.60±7.98(10)阿膠補(bǔ)血軟膠囊 1.10 137.92±7.22 100.00±13.44* 118.64±27.26(11)△△阿膠補(bǔ)血軟膠囊 0.55 134.75±11.69 102.25±10.69* 114.73±10.56(11)0 d 4 d 7 d陰性對照 等體積組別 劑量/g·kg－1造模開始各時間點Hb含量/g·L－1△

2.3 對失血性貧血小鼠血清EPO含量的影響 模型對照組小鼠眼底后靜脈叢放血合并限食造模8 d后，血清中EPO含量較陰性對照組明顯增加(P＜0.01)，這可能與機(jī)體自身反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。阿膠補(bǔ)血軟膠囊各劑量組EPO含量和模型對照組相比進(jìn)一步增加，且2.21 g·kg－1劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示這可能是其促進(jìn)造血功能的一個重要方面。見表3。

2.4 對失血性貧血小鼠負(fù)重游泳時間的影響 與陰性對照組比較，模型對照組小鼠負(fù)重游泳持續(xù)時間顯著縮短(P＜0.05)。與模型對照組比較，阿膠補(bǔ)血軟膠囊能增加小鼠負(fù)重游泳時間，其中2.21和1.10 g·kg－1劑量呈現(xiàn)較顯著的效果(P＜0.05)，表明阿膠補(bǔ)血軟膠囊能明顯增強(qiáng)失血性貧血小鼠肌力和耐力，提高其抗疲勞能力，其效果不弱于阿膠補(bǔ)血膏。

表3 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對失血性貧血小鼠血清EPO的影響(±s，n=6)

表3 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對失血性貧血小鼠血清EPO的影響(±s，n=6)

注:與模型對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.05。

組別 劑量/g·kg－1 EPO/IU·L －1陰性對照 等體積N.S 31.40±8.96＊＊0.55 66.87±27.66模型對照 等體積N.S 65.16±17.66復(fù)方阿膠漿 18mL·kg－1 70.25±20.61阿膠補(bǔ)血膏 12 81.91±31.41阿膠補(bǔ)血軟膠囊 2.21 90.41±21.06△阿膠補(bǔ)血軟膠囊 1.10 82.59±8.95阿膠補(bǔ)血軟膠囊

表4 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對失血性貧血小鼠負(fù)重游泳時間的影響(±s)

表4 阿膠補(bǔ)血軟膠囊對失血性貧血小鼠負(fù)重游泳時間的影響(±s)

注:與模型對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。

組別 劑量(g·kg－1) 游泳時間(min)陰性對照 等體積N.S 5.90±3.40*模型對照 等體積N.S 2.05±1.11(10)復(fù)方阿膠漿 18mL·kg－1 5.83±2.07(11)*阿膠補(bǔ)血膏 12 5.84±2.46*阿膠補(bǔ)血軟膠囊 2.21 5.08±2.37(10)△阿膠補(bǔ)血軟膠囊 1.10 6.03±3.13(11)△阿膠補(bǔ)血軟膠囊 0.55 3.65±1.61(11)

3 討論

阿膠補(bǔ)血軟膠囊處方由阿膠、熟地黃、黃芪、黨參等為主要原料組成。其中，阿膠被歷代醫(yī)家稱為補(bǔ)血“圣藥”［8］?，F(xiàn)代研究表明，阿膠作為一類明膠蛋白，對促進(jìn)造血系統(tǒng)功能作用顯著，有加速RBC和Hb生長，促進(jìn)骨髓造血，故有抗貧血作用［9］。熟地黃主治一切陰血不足之虛證，被譽(yù)為“壯水之主，補(bǔ)血之君”;熟地黃水煎劑及其提取物均有不同程度提高正常小鼠外周血象的趨勢，對血虛模型小鼠其補(bǔ)血作用更顯著［10］。黃芪補(bǔ)氣生血，用于氣血不足諸證?，F(xiàn)代研究證實［11－12］，黃芪能夠明顯提高動物體能，改善動物的疲勞狀態(tài)，并能夠減少血清和骨骼肌中乳酸的堆積，降低血清中乳酸脫氫酶和尿素氮的含量，以及降低血清和骨骼肌丙二醛的含量。黨參補(bǔ)中益氣，生津養(yǎng)血，用于氣血不足之證。藥理研究認(rèn)為，黨參具有抗疲勞和提高耐高溫能力，同時使RBC及Hb增加的作用［13］。上述作用均與本研究發(fā)現(xiàn)阿膠補(bǔ)血軟膠囊增加貧血小鼠RBC數(shù)和Hb含量功能密切相關(guān)。

EPO作用于骨髓紅系祖細(xì)胞上的受體，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞分化為原RBC，加速幼RBC分裂并促進(jìn)Hb的合成［14］。阿膠補(bǔ)血軟膠囊能夠增加血液中EPO含量，這可能是其促進(jìn)造血功能的一個重要方面。

小鼠游泳實驗反映小鼠肌力、耐力、應(yīng)激能力等功能，也稱Porsolt實驗［15］。本實驗圍繞阿膠補(bǔ)血軟膠囊增強(qiáng)失血小鼠耐力的功效進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，阿膠補(bǔ)血膏和阿膠補(bǔ)血軟膠囊均能顯著增加小鼠游泳時間，表明阿膠補(bǔ)血軟膠囊能明顯增強(qiáng)失血性貧血小鼠肌力和耐力，其效果與阿膠補(bǔ)血膏相當(dāng)。

本模型為急性失血性貧血，動物恢復(fù)會較快，若實施造模后治療性給藥，其治療效果勢必?zé)o法正確判斷，所以本實驗為預(yù)防性給藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠造成失血性貧血模型以后體能明顯下降，RBC數(shù)目和Hb含量明顯降低，EPO等激素則反射性地合成增加。阿膠補(bǔ)血軟膠囊在提高動物體能的同時，其RBC和Hb異常明顯改善，刺激EPO的分泌，促進(jìn)造血。這些結(jié)果為阿膠補(bǔ)血軟膠囊的進(jìn)一步研究提供了實驗依據(jù)。

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