張喜峰，楊春慧，羅光宏

1(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖，734000)2(河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅張掖，734000)

在葡萄酒加工過(guò)程中，每年產(chǎn)生約占葡萄加工量20%～30%的籽渣廢棄物，其中主要是葡萄皮種子和果梗等［1］。葡萄籽渣含有多酚類化合物［2］、白藜蘆醇［3］、花色素［4］、膳食纖維［5］、蛋白質(zhì)［6］、黃酮［7］等多種功能性成分。黃酮類化合物有明顯的抗?jié)?、抗菌、抗炎、生物抗氧化性、抗衰老、治療心腦血管疾病等藥用保健功能，是一類具有廣泛開發(fā)前景的天然抗氧化劑［8］。

賴泉斌［9］利用水提醇沉的方法獲得了葡萄籽總黃酮，但需多次提取，操作繁瑣，周期較長(zhǎng)。雙水相萃取技術(shù)具有操作條件溫和、處理量大，易于連續(xù)操作，傳質(zhì)速度快，被廣泛應(yīng)用生物化學(xué)領(lǐng)域。但傳統(tǒng)的雙水相體系有原料成本較高，高聚物回收利用困難等缺點(diǎn)。以無(wú)機(jī)鹽代替高聚物的普通有機(jī)物雙水相體系以其價(jià)廉、低度、體系簡(jiǎn)單及后續(xù)處理容易等優(yōu)點(diǎn)，適用于極性物質(zhì)提取和純化，使雙水相萃取的工業(yè)化成為可能［10］。

本文采用無(wú)水乙醇和硫酸銨雙水相體系萃取葡萄酒下腳料中的葡萄籽總黃酮。通過(guò)單因素和Box-Behnken的組合試驗(yàn)，考察粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮萃取過(guò)程中分配系數(shù)及萃取率的影響，以確定雙水相體系萃取葡萄籽總黃酮優(yōu)化條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:取甘肅濱河食品工業(yè)集團(tuán)葡萄酒下腳料，經(jīng)挑選、清洗、曬干，得到干凈的葡萄籽。

試 劑:NaNo2、Al(NO3)3、NaOH、無(wú) 水CH3CH2OH、(NH4)2SO4、NaCl均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PL-203電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，XO-SM5O超聲波-微波反應(yīng)系統(tǒng)(南京先歐儀器制造有限公司)，DKB-501數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴鍋(揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司)，DHG-9101.1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海光譜儀器有限公司，F(xiàn)Z102植物試樣粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)，722型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄籽粗提液的制備

準(zhǔn)確稱取10 g已粉碎的葡萄籽粉末，以1∶8(g∶mL)料液比加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇中，在超聲波-微波反應(yīng)系統(tǒng)下，超聲10 min，抽濾，收集濾液得葡萄籽總黃酮粗提液，測(cè)定粗提液中葡萄籽總黃酮的含量。

1.3.2 雙水相萃取方法

稱取一定量無(wú)水乙醇、(NH4)2SO4、粗提液、蒸餾水于小燒杯中，使雙水相體系總質(zhì)量為10.00 g，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，并調(diào)節(jié)體系pH，靜置10 min，兩相達(dá)到相分離，葡萄籽總黃酮富集于雙水相系統(tǒng)的上相中，測(cè)定相比R和葡萄籽總黃酮的含量［11］，并計(jì)算其分配系數(shù)K及萃取率Y，如下式:

1.3.3 黃酮含量測(cè)定

精確稱取蘆丁對(duì)照品1.0 g用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶解配制成黃酮濃度為1 mg/mL的乙醇溶液。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于6 個(gè)10 mL 容量瓶中，加入0.30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液，靜置6 min，加入 0.30 mL10%Al(NO3)3，靜置 6 min，再加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液，靜置15 min后，用水定容至刻度。分別用分光光度計(jì)于510 nm測(cè)定吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=1.245x－0.002 4，R2=0.999 2。式中x為溶液中黃酮的質(zhì)量(mg);A為吸光度值。

1.3.4 乙醇-硫酸銨雙水相體系的確定

通過(guò)改變乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定雙水相體系的組成。

1.3.5 影響葡萄籽黃酮萃取的因素

1.3.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在確定了雙水相體系組成后，研究黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響。

1.3.5.2 Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)三因素三水平17個(gè)組合Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)，確定葡萄籽黃酮萃取的最佳工藝條件。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

單因素部試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)結(jié)果的分別采用Excel和Design-Expert 7.0在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的同時(shí)按相應(yīng)方法進(jìn)行，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

在無(wú)水乙醇-(NH4)2SO4雙水相體系中，選擇19% 、21% 、23% 、25% 、27% 無(wú)水乙醇，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)22%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%組成雙水相，室溫(25℃)條件下，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定的情況下，隨著無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率和分配系數(shù)都增加，當(dāng)無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到23%時(shí)，總黃酮提取率和分配系數(shù)都達(dá)到最大，此后，隨著無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率和分配系數(shù)都顯著下降，其主要原因可能是無(wú)水乙醇質(zhì)量增加了雙水相體系的分相能力增加，黃酮在乙醇中溶解度比在水中的大，但乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，其他有機(jī)物的溶出量也會(huì)增加，而抑制了總黃酮的浸出［12］，因此，確定最佳的無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%。

圖1 無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.1 Effect of the ethnol concentration on Partitioning behaviour of grape seed total flavonoid

2.2(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

分別選取15%、17%、19%、21%、23%(NH4)2SO4，23%無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和葡萄籽總黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%分別組成雙水相體系，在室溫條件下，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

圖2(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate concentrationon Partitioning behaviour of grape seeds total flavonoid

由圖2可知，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，分配系數(shù)和萃取率先是逐漸上升，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到17%時(shí)呈下降趨勢(shì)。可見，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響雙水相體系，可以改變各相中成相物質(zhì)的組成和相比［13］，從而影響黃酮在上相中的分配，當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，雙水相體系有硫酸銨沉淀析出，影響黃酮浸出［12］，導(dǎo)致分配系數(shù)和萃取率隨(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降。因此選擇(NH4)2SO4的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%。

2.3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

在室溫下，23%無(wú)水乙醇-17%(NH4)2SO4雙水相體系中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%的黃酮粗提液，在室溫條件下，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.3 Effect of crude extract concentration on partition of grape seeds total flavonoids

粗提液加入量是雙水相萃取的一個(gè)重要參數(shù)，從成本考慮多加入一些。如圖3所示，粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響上下相的分配，當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.5%時(shí)萃取率和分配系數(shù)最大。因此，確定粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)最佳為17.5%。

2.4 pH值對(duì)葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

將23%無(wú)水乙醇-17%(NH4)2SO4和17.5%葡萄籽總黃酮粗提液，在室溫(25℃)條件下，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)體系 pH值，在 pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行分析。

圖4 pH值對(duì)葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.4 Effect of pH value on partition behaviour of grape seeds total flavonoids

如圖4所示，pH＜7時(shí)，隨著pH值增大分配系數(shù)和萃取率逐漸增大;pH=7時(shí)分配系數(shù)和萃取率達(dá)最大;當(dāng)pH＞7時(shí)，分配系數(shù)和萃取率隨pH值的增大而減小。在無(wú)水乙醇-(NH4)2SO4雙水相體系中，上相電位為正，下相電位為負(fù)，當(dāng)pH值較低時(shí)，黃酮的電離平衡受到影響，并吸附H+而攜帶正電荷，pH值改變了黃酮的電荷性質(zhì)，黃酮開始向電位為負(fù)的下相富集，分配系數(shù)下降，但堿性過(guò)強(qiáng)時(shí)，會(huì)破壞黃酮母核，導(dǎo)致黃酮的萃取率降低［13－14］。因此選擇pH 7。

2.5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%的無(wú)水乙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%(NH4)2SO4作為雙水相體系，在 pH 7、室溫(25℃)條件下，分別加入 0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3.0%NaCl，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行分析。

由圖5可知，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，分配系數(shù)變化基本與萃取率的變化同步。無(wú)機(jī)鹽的加入可以改變兩相間的電位差和相比，縮短了分相時(shí)間，提高了相分離速度，從而增加了黃酮在上相的分配，但鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到一定程度后，萃取相的極性增強(qiáng)，使黃酮的溶解度下降導(dǎo)致出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，使分配系數(shù)降低［15］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，NaCl添加量為2.5%時(shí)，萃取率最高。因此，選擇NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇2.5%左右為宜。

圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.5 Effects of NaCl concentration on partitioning behaviour of grape seed total flavonoids

2.6 響應(yīng)面結(jié)果分析

根據(jù)以上單因素的試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面方法進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件。據(jù)Box-Behnken的組合設(shè)計(jì)原理，以萃取率為響應(yīng)值，在無(wú)水乙醇-(NH4)2SO4體系基礎(chǔ)上，對(duì)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、pH值(B)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)設(shè)計(jì)了3因素3水平的17組試驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。選取的試驗(yàn)因素和水平見表1，試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels ofBox-Behnken Design

2.6.1 Box-Benhnken Design試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken Design

以葡萄籽總黃酮萃取率Y為響應(yīng)值，根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，用Design-Expert7.0軟件進(jìn)行多元回歸分析，具體結(jié)果見表3。經(jīng)回歸擬合后，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用以下回歸方程表示:

回歸分析見表3。由表3可知，模型P=0.000 3＜0.05，說(shuō)明模型擬合程度極顯著。失擬項(xiàng) P=0.064 0＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，模型決定系數(shù)為96.54%，說(shuō)明回歸方程擬合程度較好。該模型中A、B、A2、C2極顯著，C、B2顯著，其他項(xiàng)系數(shù)均不顯著，從表3可看出，A、B、C對(duì)黃酮萃取率均有一定影響，按照對(duì)結(jié)果的影響排序:pH(B)＞粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)＞NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析Table 3 The regression analysis of Box-Behnken experiment results

2.6.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

利用Design-Expert軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制等高線圖，結(jié)果如圖6所示，利用Design-Expert軟件對(duì)黃酮萃取率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型進(jìn)行求導(dǎo)，可獲得該模型極值點(diǎn)，對(duì)函數(shù)進(jìn)行分析，獲得了各個(gè)因素的最佳條件組合:pH 7.2、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.97%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.3%。此時(shí)模型預(yù)測(cè)極大值為96.437 2%。

圖6 各因素交互作用的等高線圖Fig.6 Response plots for the pairwise interactive effects

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在雙水相體系組成不變情況下，在優(yōu)化條件下進(jìn)行3組試驗(yàn)，黃酮萃取率平均達(dá)到98.8%，與模型預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型能準(zhǔn)確預(yù)見實(shí)際萃取情況。

3 結(jié)論

雙水相體系中乙醇、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮萃取率和分配系數(shù)均有影響。確定雙水相體系組成23%無(wú)水乙醇-17%(NH4)2SO4;葡萄籽黃酮所需的最佳萃取條件為:粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.3%、pH 7.2、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.97%，萃取率達(dá)到98.8%;該法方法簡(jiǎn)單，易于掌握，采用低毒的無(wú)水乙醇，利于環(huán)保且節(jié)約試劑。

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