魏 琴，殷中瓊，杜永華，周黎軍，2，陶 翠，賈仁勇

（1.宜賓學(xué)院 發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓644007；2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓644007；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安625014；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安625014）

樟葉入藥古已有之，《綱目拾遺》記載：樟樹葉有祛風(fēng)，除濕，止痛，殺蟲之功效，主治風(fēng)濕骨痛，跌打損傷，疥癬?，F(xiàn)代研究表明，香樟（Cinnamomum.camphora）葉乙醇提取物具有明顯抑菌作用［1］，樟葉甲醇提取物及其乙酸乙酯萃取物能抑制多種炎癥因子的產(chǎn)率［2］。油樟［Cinnamomumlongepaniculatum（Gamble）N.Chao］是樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）植物，主產(chǎn)于四川宜賓，其葉富含芳香油，每年提取油樟油后拋棄大量殘?jiān)碑a(chǎn)物，不僅浪費(fèi)資源，還污染環(huán)境。為充分利用與合理開發(fā)油樟副產(chǎn)物資源，本試驗(yàn)研究了油樟葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠，雌雄各半，體重18～22g；SD大鼠，雌雄各半，體重180～220g，均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

1.2 藥品和試劑 伊文思藍(lán)（Evans blue）為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；角叉菜膠為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；吲哚美辛為山西臨汾奇林藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；冰乙酸為成都天華科技股份有限公司產(chǎn)品；二甲苯為湖北沙市化工試劑廠產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 YLS－6A智能熱板儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；MA200型電子分析天平，上海第二天平儀器廠。

1.4 油樟葉乙酸乙酯萃取物的制備 將提過揮發(fā)油的油樟葉殘?jiān)?5℃烘干，粉碎過20目篩，加入10倍量95%乙醇，85℃水浴回流8h，過濾，濾液濃縮得乙醇浸膏，將乙醇浸膏用水均勻分散，用石油醚萃取脫脂，水溶液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，濃縮干燥即得乙酸乙酯萃取物。將油樟葉乙酸乙酯萃取物用0.5%羧甲基纖維素（CMC）溶液超聲溶解，配成125mg/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL溶液（以生藥量計(jì)算），4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 鎮(zhèn)痛作用

1.5.1 小鼠醋酸扭體試驗(yàn)［3］取小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半，其中3組為藥物組，其余為羧甲基纖維素溶劑對(duì)照組和吲哚美辛對(duì)照組。各組均按體重給藥，藥物組劑量分別為2.5 g/kg、1.25g/kg、0.625g/kg；吲哚美辛對(duì)照組劑量為2mg/kg；溶劑對(duì)照組劑量為20mL/kg；連續(xù)灌胃給藥4d，每天1次。各組小鼠末次灌胃后1h，每只小鼠按10mL/kg體重的劑量，腹腔注射0.7%冰醋酸溶液，記錄小鼠20min內(nèi)扭體反應(yīng)（腹部?jī)?nèi)凹，伸展后肢，臀部抬高）次數(shù)。按下式計(jì)算扭體抑制率：抑制率（%）＝［（對(duì)照組扭體次數(shù)一給藥組扭體次數(shù)）/對(duì)照組扭體次數(shù)］×100%。

1.5.2 小鼠電熱板試驗(yàn)［3］小鼠置于（55.5℃±0.5℃）恒溫?zé)岚迳?，以舔后足為指?biāo)，篩選痛閾值在5s～30s的小鼠50只，按“1.5.1”項(xiàng)分組及給藥。末次灌胃30min后，分別于30、60、90、120min測(cè)定各小鼠灌胃后的痛閾值。在測(cè)定中，如60s內(nèi)無痛反應(yīng)，應(yīng)立即取出，并以60s計(jì)算。按下式計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率計(jì)算公式：鎮(zhèn)痛率（%）＝［（給藥組痛閾值－對(duì)照組痛閾值）/對(duì)照組痛閾值］×100%。

1.6 抗炎作用

1.6.1 二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹試驗(yàn)［4］取小鼠50只，按“1.5.1”項(xiàng)分組及給藥。末次給藥后1h于小鼠左耳前后兩面涂抹二甲苯，每只0.02mL，右耳作對(duì)照，1h后將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑6mm的打孔器分別在同一部位打下圓耳片，用分析天平稱重，以左右耳片之差為腫脹度。按下式計(jì)算腫脹抑制率：抑制率（%）＝［（溶劑對(duì)照組腫脹度－藥物組腫脹度）/溶劑對(duì)照組腫脹度］×100%。

1.6.2 醋酸誘導(dǎo)小鼠毛細(xì)血管通透性增高試驗(yàn)［5］按“1.5.1”項(xiàng)分組及給藥。末次給藥后1h，各小鼠均靜脈注射5g/L伊文思藍(lán)10mL/kg，隨即腹腔注射6g/L醋酸0.2mL/只，20min后脫頸椎處死，腹腔注射生理鹽水5mL，輕揉腹部0.5min，5min后剪開腹部肌肉，吸出腹腔洗滌液，3 000r/min離心15min，取上清液，用721型分光光度計(jì)于590 nm波長(zhǎng)測(cè)定伊文思藍(lán)的吸光度值A(chǔ)。按下式計(jì)算抑制率：抑制率（%）＝［（溶劑對(duì)照組吸光度值－藥物組吸光度值）/溶劑對(duì)照組吸光度值］×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各配對(duì)資料間比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料的多重比較采用q檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 結(jié)果見表1。與溶劑對(duì)照組相比，油樟葉乙酸乙酯萃取物中高劑量組能顯著減少醋酸所致小鼠扭體的次數(shù)，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，劑量為2.5g/kg體重時(shí)的鎮(zhèn)痛效果與2mg/kg體重吲哚美辛相近，其鎮(zhèn)痛百分率分別為73.95%和78.55%。

表1 油樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 （±SD）

表1 油樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 （±SD）

注：與溶劑對(duì)照組相比；＊：P＜0.05；＊＊：P ＜0.01。下表同

組別 劑量 扭體次數(shù) 鎮(zhèn)痛百分率（%）溶劑對(duì)照組 20mL/kg 29.75±3.15 －吲哚美辛組 2mg/kg 6.38±3.96＊＊ 78.55乙酸乙酯高劑量組 2.5g/kg 7.75±5.18＊＊ 73.95乙酸乙酯中劑量組 1.25g/kg 22.13±6.06＊ 25.63乙酸乙酯低劑量 0.625g/kg 25.25±5.78 15.13

2.2 對(duì)小鼠電熱板反應(yīng)的影響 結(jié)果見表2。與溶劑對(duì)照組相比，油樟葉乙酸乙酯萃取物各劑量與吲哚美辛在90min以前無明顯鎮(zhèn)痛作用，120min時(shí)高劑量組開始出現(xiàn)顯著的鎮(zhèn)痛作用（P＜0.05），其鎮(zhèn)痛率為40.79%。

表2 油樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)小鼠電熱板反應(yīng)的影響 （±SD）

表2 油樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)小鼠電熱板反應(yīng)的影響 （±SD）

組別 劑量鎮(zhèn)痛率（﹪）30min 60min 90min 120min溶劑對(duì)照組 20mL/kg － － － －吲哚美辛組 2mg/kg 28.96±8.28 32.60±7.52 35.79±6.48 44.05±8.59＊＊乙酸乙酯高劑量組 2.5g/kg 21.19±5.39 29.60±7.69 10.31±4.03 40.79±13.59＊乙酸乙酯中劑量組 1.25g/kg 11.61±6.79 18.75±7.22 7.31±1.58 33.57±10.21乙酸乙酯低劑量組 0.625g/kg 9.46±4.03 16.27±4.39 5.32±2.98 3.54±2.27

2.3 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹作用的影響 結(jié)果見表3。與溶劑對(duì)照組相比，乙酸乙酯萃取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹具有一定降低作用，且具有劑量依賴性，高劑量組能顯著降低小鼠耳腫脹（P＜0.05），其抑制率為12.85%，其他劑量組無明顯抑制作用。乙酸乙酯萃取物的抑制作用低于吲哚美辛。

表3 油樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹作用的影響

2.4 對(duì)醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的影響結(jié)果見表4。與溶劑對(duì)照相比，乙酸乙酯萃取物能極顯著降低小鼠腹腔透過的染料量（P＜0.01），有較強(qiáng)的劑量依賴性抗炎作用，高劑量組的作用略低于吲哚美辛，其抑制率分別為73.62%和77.95%。

表4 油樟葉乙酸乙酯萃取物對(duì)醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的影響

3 分析與討論

疼痛是伴有現(xiàn)存組織損傷和潛在組織損傷的一種不愉快的感覺和情緒上的主觀感受，是許多疾病的伴隨癥狀，疼痛得不到緩解不利于機(jī)體康復(fù)［6］。藥物治療是緩解疼痛的主要措施之一。小鼠扭體法（化學(xué)刺激）和小鼠熱板法（物理刺激）是鎮(zhèn)痛藥物研究的常用方法。扭體法是將刺激劑注入小鼠腹腔，引起炎性介質(zhì)前列腺素的釋放，誘導(dǎo)產(chǎn)生疼痛，該模型常用作外周鎮(zhèn)痛藥的篩選；熱板法是利用小鼠爪趾對(duì)熱刺激非常敏感的特性，小鼠主要表現(xiàn)為跳躍、縮足、舔足，該模型常用作中樞性鎮(zhèn)痛藥鎮(zhèn)痛作用的評(píng)價(jià)［7］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，油樟葉乙酸乙酯萃取物能顯著減少醋酸所致小鼠扭體次數(shù)，對(duì)熱板法試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜔o顯著鎮(zhèn)痛作用，說明油樟葉乙酸乙酯萃取物具有一定的外周鎮(zhèn)痛作用，無明顯中樞鎮(zhèn)痛作用，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

炎癥是機(jī)體對(duì)致炎因素的局部損傷所產(chǎn)生的防御性應(yīng)答反應(yīng)，其典型特征是紅、腫、熱、痛和功能障礙。非特異性炎癥反應(yīng)存在3個(gè)時(shí)相，即急性期以局部血管擴(kuò)張和毛細(xì)血管通透性增加為特征；亞急性期以白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)為特征；慢性增殖期以組織變性和纖維化為特征［3］。炎癥急性期的毛細(xì)血管擴(kuò)張和毛細(xì)血管通透性升高，可加速炎性滲出，使血管內(nèi)液體成分和炎癥細(xì)胞進(jìn)入組織中引起局部腫脹［8］。二甲苯可引起耳廓急性炎癥水腫，醋酸可引起小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，油樟葉乙酸乙酯萃取物高劑量組能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，所有劑量組能極顯著地抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管內(nèi)通透性升高?？梢?，油樟葉乙酸乙酯萃取物能抑制毛細(xì)血管通透性升高，表現(xiàn)出一定的抗炎作用，但其減輕炎癥急性期腫脹作用較弱。這可能是由于乙酸乙酯萃取物對(duì)于毛細(xì)血管通透性增加所致炎性滲出的抑制程度小于其他因素所致炎性滲出，從而導(dǎo)致中低劑量組不能顯著抑制炎性組織腫脹。

研究表明，香樟（C.camphora）、土肉桂（C.osmophloeum）和臺(tái)灣肉桂（C.insularimontanum）等樟屬植物的提取物對(duì)PGE2、NO、TNF－α、IL－1β、IL－12和IL－6等多種炎癥介質(zhì)具有明顯抑制作用［2，9－10］，并從土肉桂中分離出具有抗炎活性的黃酮苷類物質(zhì)［9］。對(duì)于油樟葉中鎮(zhèn)痛抗炎活性成分的分離鑒定及其抗炎機(jī)理，有待進(jìn)一步研究。

［1］ 吳傳茂，吳周和，伍業(yè)松.樟樹葉乙醇提取液的抑菌作用［J］.氨基酸和生物資源，2000，22（2）：41－42.

［2］ Lee H J，Hyun E A，Yoon W J，etal.In vitro anti－inflammatory and anti－oxidative effects ofCinnamomumcamphoraextracts［J］.Journal of Ethnopharmacology，2006，103：208－216.

［3］ 徐淑云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)試驗(yàn)方法［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：882－887，906.

［4］ Weirich E G，Longauer J K，Kirkwood A H.New experimental model for the primary evaluation of topical contra－inflammatory agents ［J］.Archives of Dermatological Research，1977，259（2）：141－149.

［5］ Blackham A，Woods F A M.Immune Complex Mediated Inflammation in the Mouse Peritoneal Cavity：A Method for Investigating Inhibitors of Arachidonate Metabolism［J］.Journal of pharmacological methods，1986，15（1）：77－85.

［6］ 楊雪華.疼痛的評(píng)估與護(hù)理進(jìn)展［J］.護(hù)理研究，2005，19（8）：1423－1425.

［7］ 陳玉立，陳素，劉向明.龍血竭鎮(zhèn)痛和阻滯神經(jīng)傳導(dǎo)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（10）：30－31.

［8］ Prempeh A B A，Mensah－Attipoe J.Inhibition of vascular response in inflammation by crude aqueous extract of the root bark ofZanthoxylumXanthoxyloides［J］.Ghana Medical Journal，2009，43（2）：77－81.

［9］ Fang S H，Rao Y K，Tzeng Y M.Inhibitory effects of flavonol glycosides fromCinnamomumosmophloeumon inflammatory mediators in LPS/IFN－γ－activated murine macrophages［J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry，2005，13（7）：2381－2388.

［10］Lin C T，Chen C J，Lin T Y，etal.Anti－inflammation activity of fruit essential oil fromCinnamomuminsularimontanumHayata［J］.Bioresource Technology，2008，99（18）：8783－8787.