臧瑩安，李婉雁，龐木生，李 淼，宋 帥，李春玲

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科學(xué)系，廣東 廣州510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東 廣州510640；3.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東 廣州510640）

副豬嗜血桿菌病是近年來嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的疾病，并已證實在中國絕大多數(shù)豬場存在和流行，且流行的主要血清型為4型、5型、12型［1－2］。目前對Hps致病機(jī)理的研究日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。然而，對這些致病因子在致病過程中的作用機(jī)制還缺乏系統(tǒng)深入的了解和認(rèn)識［3－4］。外膜蛋白（OMP）是重要的致病因子之一，具有良好的免疫原性，不僅可刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫反應(yīng)，也可產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)［5］，但OMP是否為主要的免疫原仍需進(jìn)一步研究［6］。且由于OMP的疏水特性，其分離和分析較為困難，從而成為當(dāng)今微生物界的一個研究重點和難點。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，探索4、5、12血清型副豬嗜血桿菌OMP的提取方法，為OMP的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 4、5、12型Hps由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所豬病研究室保存。

1.2 主要儀器 SCIENTZ－ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，購自上海蘭科儀器；Mycycler PCR儀，購自TaKaRa公司；BIO－RAD Model 680酶標(biāo)儀，購自上海天呈科技有限公司；DYY－5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，購自北京六一儀器廠；Tanon全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)，購自上海天能公司。

1.3 主要試劑 牛血清蛋白、過硫酸銨、β巰基乙酸均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Protein MW Marker，購自TaKaRa公司；考馬斯亮藍(lán)R－250、丙烯酰胺、N，N－甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、十二烷基肌氨酸鈉、甘氨酸，N，N，N，N－四甲基乙二胺（TEMED），均購自河南華美生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 細(xì)菌外膜蛋白的提取 利用十二烷基肌氨酸鈉結(jié)合超速離心法提取Hps的OMP。參考空腸彎曲桿菌OMP的提取方法［15］，前期超聲波裂解條件為：功率400W，超聲3s，間隙5s，超聲5min；降低超聲波功率和相對延長循環(huán)時間進(jìn)一步優(yōu)化裂解條件，功率分別為：300、200、100、50W，循環(huán)時間分別為：10、20、30、40min。多次嘗試后重新確定超聲波破碎條件。

1.4.2 外膜蛋白濃度的測定 根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒的檢測方法測定OMP濃度。方法如下：配制工作液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，然后分別加20μL樣品到96孔板樣品孔中，再于各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置15～30min后用酶標(biāo)儀測定OD570，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為縱坐標(biāo)，OD570為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。待測樣品蛋白濃度＝待測樣品OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度×外膜蛋白稀釋倍數(shù)。

1.4.3 外膜蛋白SDS－PAGE電泳 按常規(guī)方法操作，觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 外膜蛋白濃度測定結(jié)果 見圖1和表1。

圖1 蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程是：y＝1.6173x－0.2372，R2＝0.9814，依公式換算出4、5、12三種血清型OMP的平均濃度分別為0.163mg/mL、0.163 mg/mL、0.167mg/mL。

表1顯示3種血清型（4、5、12）的OMP的蛋白濃度差異不顯著（P＞0.05）。可以說明，通過此方法提取這3種血清型的OMP的蛋白濃度差異不顯著，這個提取方法具有參考價值。

表1 待測蛋白OD570值及其對應(yīng)的蛋白濃度

2.2 外膜蛋白SDS－PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果 本試驗共提取了Hps的3個主要血清型（4、5、12）的OMP，前期參考空腸彎曲桿菌OMP的提取方法［15］，凝膠電泳無清晰可見的蛋白條帶。后多次調(diào)整，將超聲波條件調(diào)整為功率96W超聲破碎時間3s，間隔時間5s，循環(huán)作用30min，凝膠電泳顯示蛋白條帶清晰。如圖3，每個血清型的OMP都有多個分子量大小不同的蛋白條帶，且條帶的粗細(xì)和顏色深淺不一致，說明每個血清型的OMP有多種不同的蛋白質(zhì)構(gòu)成，且每種蛋白質(zhì)的含量都不同。不同血清型的SDS－PAGE圖譜有大小相同或相近的條帶，也有差距較大的條帶，如4型和5型Hps的OMP條帶都集中在分子質(zhì)量大小60kDa～97.2 kDa之間，而12型Hps的OMP條帶則集中在分子質(zhì)量大小66.4kDa～200kDa之間。4型 Hps的OMP條帶中，分子質(zhì)量大小60kDa和62kDa為高表達(dá)蛋白；5型Hps的OMP條帶中，分子質(zhì)量大小60kDa、62kDa和70kDa的蛋白質(zhì)為高表達(dá)蛋白；12型Hps的OMP條帶中，分子質(zhì)量大小70kDa、116kDa和200kDa的蛋白質(zhì)為高表達(dá)蛋白。

圖2 探索超聲波條件試驗結(jié)果的SDS－PAGE分析圖

圖3 Hps 3種血清型（4、5、12）的外膜蛋白SDS－PAGE分析圖

3 討論

3.1 關(guān)于外膜蛋白的提取方法 常用的OMP提取方法主要有等密度梯度離心法、Sarkosyl法和碳酸鈉法，這些方法耗時長，設(shè)備儀器要求高，提取步驟繁多，同時很難嚴(yán)格地將同屬膜結(jié)構(gòu)的質(zhì)膜與外膜區(qū)分開來［7－9］。目前，對大腸桿菌OMP的提取一般采用超聲波裂解，再用膜裂解劑十二烷基肌氨酸（Sarkosyl）提取其 OMP組分［10－11］，但有研究發(fā)現(xiàn)使用8%的Triton X－114處理3h能有效提高OMP的提取效率［9］。沙門菌外膜蛋白的提取，成進(jìn)等［12］采用尿素、EDTA作為鰲合劑，粗提品再經(jīng)過丙酮沉淀和硫酸銨分級沉淀進(jìn)行提純，若需不同分子量的蛋白質(zhì)組分，可在SDS－PAGE后用洗脫法制備；夏文浪等［13］在研究空腸彎曲菌67kDa OMP對淋巴細(xì)胞的多克隆激活作用時，首先將菌液超聲裂解，然后用40%飽和度的（NH4）2SO4沉淀，最后再用DEAE－52離子交換層析進(jìn)一步提純。有研究顯示采用甘氨酸提取、SephadexG－75純化空腸彎曲菌28kDa～31kDa OMP系一種穩(wěn)定可靠的分離層析方法［14］。本試驗參考空腸彎曲桿菌OMP的提取方法［15］，采用超聲波裂解，再用膜裂解劑十二烷基肌氨酸提取其OMP組分。按照原來的超聲波裂解條件為：功率400 W，超聲3s，間隙5s，超聲5min，但是結(jié)果顯示，這樣的超聲波破碎條件所提取出來的OMP在SDS－PAGE凝膠電泳結(jié)果上沒有清晰可見的蛋白條帶。這可能是由于超聲波功率過大的原因。所以嘗試降低超聲波功率并相對延長循環(huán)時間的方法重新確定超聲波裂解條件為：功率96W超聲破碎時間3s，間隔時間5s，循環(huán)作用30min，SDS－PAGE凝膠電泳顯示蛋白條帶清晰，結(jié)果顯示良好。

3.2 關(guān)于外膜蛋白濃度的測定 用Bradford檢測方法測定副豬嗜血桿菌3種血清型（4、5、12），OMP的平均濃度分別為0.163mg/mL、0.163mg/mL、0.167mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)方程的決定系數(shù)是R2＝0.981 4，說明此次測定結(jié)果與真實值較接近，測定結(jié)果的準(zhǔn)確性較高。測定OMP的濃度，對于進(jìn)一步分析全菌中OMP的含量有重要作用，而OMP是Hps的毒力因子之一，是分析Hps致病性的重要因素之一。因此，測定OMP的濃度，也是推測Hps致病力強弱的重要依據(jù)。

3.3 關(guān)于SDS－PAGE凝膠電泳 本次SDS－PAGE凝膠電泳采用的是傳統(tǒng)的方法。結(jié)果顯示，每個血清型的OMP并不僅僅有一種蛋白質(zhì)，而是有多種不同的蛋白質(zhì)，且每種蛋白質(zhì)的含量都不同，不同血清型Hps的OMP有分子量大小相同的蛋白，也有分子量大小不同的蛋白，且不同血清型副豬嗜血桿菌的膜蛋白結(jié)果有相似性。但各血清型膜蛋白的具體情況和差異還有待于進(jìn)一步研究。分析OMP的分子質(zhì)量大小，是進(jìn)一步掌握OMP結(jié)構(gòu)和組成的基礎(chǔ)，也是研究和分析OMP免疫功能的前提條件。

目前的大多數(shù)研究中，還是以全菌研究為主，也許是由于半菌的毒力不足以達(dá)到相應(yīng)的毒力，進(jìn)而影響到試驗結(jié)果［16］。某些細(xì)菌的不同血清型間有相同的OMP免疫原性，可以產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，這不僅為開發(fā)OMP亞單位疫苗提供了理論基礎(chǔ)，而且為疾病的診斷提供了特異性抗原，今后必將成為細(xì)菌領(lǐng)域的研究重點之一。

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