潘楠楠 王敏 馮海燕 鄭乃智

研究發(fā)現(xiàn)大約有35%的癲癇患者可伴隨抑郁癥[1]，同時(shí)抑郁樣精神行為改變也可能是癲癇發(fā)作的危險(xiǎn)因素之一[2]。關(guān)于癲癇與抑郁之間的相互關(guān)系并不明確，，但是抑郁造成癲癇易發(fā)的具體機(jī)制尚不清楚，而且也沒(méi)有關(guān)于幼年及成年抑郁和癲癇的比較。

出生后早期是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的高峰期，在這個(gè)時(shí)期經(jīng)歷應(yīng)激，會(huì)對(duì)幼兒期及成年以后的行為及心理發(fā)育造成影響[3]。大量實(shí)驗(yàn)證明，出生后早期應(yīng)激可以造成大鼠行為及神經(jīng)分泌異常[4-5]。本研究采用母愛(ài)剝奪建立大鼠抑郁模型，評(píng)估抑郁狀態(tài)后癲癇模型，觀察癲癇發(fā)作潛伏期，探索癲癇發(fā)作第1周及第4周后與抑郁應(yīng)激結(jié)束1周及4周后顆粒層細(xì)胞數(shù)變化，考察抑郁及急性癲癇發(fā)作后海馬區(qū)顆粒層神經(jīng)細(xì)胞的變化，進(jìn)一步揭示抑郁狀態(tài)對(duì)癲癇易感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組出生當(dāng)天的SPF級(jí)SD大鼠與母鼠一并購(gòu)于廣東省動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。母鼠喂養(yǎng)飼料，飲用消毒水，日夜周期為12/12 h，室溫在20℃～25℃左右。大鼠在P21斷乳分籠飼養(yǎng)。

6窩新生雄性大鼠隨機(jī)分為母愛(ài)剝奪組（M,n=20）和對(duì)照組（C,n=20）。M組雄性大鼠出生后接受母愛(ài)剝奪應(yīng)激，C組不給予任何處理；在大鼠P34，以上兩組大鼠各隨機(jī)分為兩組，其中一組接受匹魯卡品腹腔注射，建立癲癇模型，分別為母愛(ài)剝奪+匹魯卡品組（M+P）和對(duì)照+匹魯卡品組(C+P)，另外一組接受同等劑量的生理鹽水腹腔注射，分別為母愛(ài)剝奪+生理鹽水組(M+S)和對(duì)照組+生理鹽水組(C+S)。

1.2 方法

1.2.1 母愛(ài)剝奪應(yīng)激采用改良母愛(ài)剝奪應(yīng)激方法[6]建立母愛(ài)剝奪大鼠模型，對(duì)照組老鼠不予以任何處理。

1.2.2 體重大鼠斷乳后分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，每天8:00 am測(cè)大鼠體重，連續(xù)監(jiān)測(cè)5 d，記錄大鼠每日體重。

1.2.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)糖水偏好實(shí)驗(yàn)參照Vazquez V等和Willner P[7-8]等實(shí)驗(yàn)方法，計(jì)算大鼠飲用的蔗糖水量占總飲水量的比例及其與體重的比例。

1.2.4 建立癲癇模型參考John J等[9]方法建立癲癇模型。癲癇發(fā)作按照Racine’s法分為5級(jí)。記錄大鼠首次出現(xiàn)癲癇發(fā)作的時(shí)間、首次出現(xiàn)Ⅳ及Ⅴ級(jí)發(fā)作的時(shí)間。

1.2.5 取材在癲癇模型建立后1周及4周，每組隨機(jī)取5只大鼠，將大鼠以10%水合氯醛(35 mL/kg)麻醉，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，4℃的生理鹽水約150 mL沖洗后灌注4%多聚甲醛400 mL，取腦后浸入4%多聚甲醛，后固定(4～6)h。隨后依次置于20%、30%蔗糖溶液至沉底，冰凍切片機(jī)（Leica德國(guó)）冠狀位連續(xù)切片，片厚10 μm。自前囟后3.3～3.8 mm，每隔5張取1張腦片。置于-40℃冰箱備用。

1.2.6 NeuN免疫熒光染色冰凍切片自-40℃冰箱取出后，室溫下復(fù)溫10 min，0.3%TritonX-100，室溫孵育10 min，0.01 MPBS(pH7.4)洗3次；滴加5%BSA封閉液，室溫孵育lh；滴加單克隆小鼠抗大鼠NeuN 抗 體(Chemicon International Inc，Temecula，CA，美國(guó))在4℃孵育16 h；0.01 MPBS洗3次；滴加FITC-偶聯(lián)的抗小鼠二抗，室溫避光孵育1h；0.01MPBS洗3次；共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料數(shù)據(jù)用表示，ANOVA方差分析數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體重與每日體重增長(zhǎng)量母愛(ài)剝奪組大鼠體重（55.33±5.17 g）與對(duì)照組大鼠體重（78.64±1.51 g）相比顯著減輕（P＜0.05）；連續(xù)監(jiān)測(cè)5 d內(nèi)每日體重增長(zhǎng)，結(jié)果顯示母愛(ài)剝奪組大鼠每日體重增長(zhǎng)量（2.78±0.36 g）顯著低于對(duì)照組大鼠（5.84±1.03 g，P ＜ 0.05）（見(jiàn)圖1）。

2.2 抑郁發(fā)生情況在蔗糖偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)中，母愛(ài)剝奪組大鼠蔗糖偏愛(ài)比例(59.29%±5.59%)比對(duì)照組（77.06%±3.34%）顯著降低（P＜0.05）,母愛(ài)剝奪組大鼠蔗糖消耗比例（66.17±4.58 mL/Kg）與對(duì)照組相比顯著降低（85.90±7.54 mL/Kg,P＜ 0.05，見(jiàn)圖2）。

2.3 癲癇發(fā)作情況給予同等劑量的匹魯卡品后，母愛(ài)剝奪組大鼠首次出現(xiàn)癲癇發(fā)作的時(shí)間（3.62±0.37 min）較對(duì)照組顯著縮短（6.37±0.59 min,P＜0.05）。母愛(ài)剝奪組大鼠首次達(dá)到Racine’s法Ⅳ級(jí)發(fā)作的時(shí)間（8.87±0.87 min）較對(duì)照組顯著縮短（13.50±1.16 min,P＜0.05，見(jiàn)圖3）。

2.4 海馬齒狀回顆粒層神經(jīng)元變化NeuN免疫熒光染色(見(jiàn)圖4)：癲癇模型建立后1周，母愛(ài)剝奪+生理鹽水組大鼠海馬顆粒層NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照+生理鹽水組減少，而對(duì)照+匹魯卡品組大鼠海馬顆粒層NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照+生理鹽水組增多；癲癇模型建立后4周，母愛(ài)剝奪+生理鹽水組大鼠海馬顆粒層NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較癲癇模型建立后1周顯著增加，但仍少于對(duì)照+生理鹽水組對(duì)照組，而對(duì)照+匹魯卡品組大鼠海馬顆粒層NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加不明顯，但仍較對(duì)照+生理鹽水組增多（見(jiàn)表1）。

3 討論

圖1 大鼠體重與每日體重增長(zhǎng)量*與對(duì)照組相比，P＜0.05

圖2 大鼠蔗糖偏愛(ài)與蔗糖消耗*與對(duì)照組相比，P＜0.05

圖3 大鼠癲癇發(fā)作情況 *與對(duì)照組相比，P＜0.05

圖4 大鼠海馬顆粒層NeuN免疫熒光細(xì)胞數(shù) A為對(duì)照+生理鹽水組；B為母愛(ài)剝奪+生理鹽水組；C為對(duì)照+匹魯卡品組。標(biāo)尺為10 μm

表1 大鼠海馬顆粒層NeuN染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）

抑郁癥為常見(jiàn)的神經(jīng)心理疾病，其核心癥狀為情緒低落、思維遲緩、意志活動(dòng)減退,還可能出現(xiàn)睡眠障礙、反復(fù)自殺念頭等[10]。Phillips等[11]對(duì)我國(guó)四個(gè)省市進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)抑郁癥患病率約為2.06%。大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，出生后早期應(yīng)激可以導(dǎo)致成年后出現(xiàn)抑郁樣精神行為改變[12-13]。出生后早期應(yīng)激（如睡眠剝奪、社會(huì)隔離等）均能引起海馬區(qū)神經(jīng)元損傷，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)目減少，而海馬與記憶及學(xué)習(xí)密切相關(guān)，目前研究認(rèn)為，海馬區(qū)對(duì)應(yīng)激敏感，而應(yīng)激對(duì)海馬造成的損害可能是導(dǎo)致抑郁樣精神行為改變的病理學(xué)基礎(chǔ)[14]。目前關(guān)于抑郁大鼠模型有很多種，其中母愛(ài)剝奪應(yīng)激大鼠模型是最成熟的抑郁大鼠模型，模擬人類(lèi)出生早期幼兒與母親的相互關(guān)系，研究證實(shí)慢性、低程度的應(yīng)激即可造成海馬區(qū)CA1、CA3和顆粒層的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation,LTP）突觸傳遞效能，造成記憶能力減退[15-17]。

癲癇是與早年應(yīng)激密切相關(guān)的一類(lèi)疾病，大多數(shù)癲癇患者都是幼兒或兒童期起病，其發(fā)病的具體機(jī)制尚不明確，一項(xiàng)對(duì)顳葉癲癇手術(shù)治療患者的調(diào)查顯示，大部分患者都有幼兒期發(fā)熱驚厥史[18]。Li H等[19]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激對(duì)癲癇發(fā)作后海馬區(qū)分子信號(hào)、細(xì)胞形態(tài)及大鼠行為改變具有協(xié)同作用。有研究者指出應(yīng)激可能通過(guò)以下4個(gè)方面來(lái)影響癲癇易發(fā)性：①內(nèi)分泌改變；②皮層或者皮層下結(jié)構(gòu)改變；③神經(jīng)遞質(zhì)異常；④免疫系統(tǒng)紊亂。其中皮層及皮層下結(jié)構(gòu)改變已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可，在動(dòng)物抑郁模型中發(fā)現(xiàn)，成年動(dòng)物海馬CA3區(qū)細(xì)胞數(shù)目減少[20]，這與在慢性癲癇動(dòng)物模型中的發(fā)現(xiàn)一致[21]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用母愛(ài)剝奪應(yīng)激成功建立大鼠抑郁模型后，大鼠對(duì)匹魯卡品敏感性顯著增加，癲癇發(fā)作潛伏期顯著較對(duì)照組縮短，說(shuō)明母愛(ài)剝奪應(yīng)激對(duì)癲癇發(fā)作具有易化作用。我們采用NeuN免疫熒光技術(shù)觀察癲癇發(fā)作后1周及4周大鼠海馬區(qū)顆粒層神經(jīng)元數(shù)目改變，發(fā)現(xiàn)母愛(ài)剝奪應(yīng)激對(duì)大鼠顆粒層神經(jīng)發(fā)生的影響從幼年時(shí)期持續(xù)到大鼠成年以后，支持早年應(yīng)激可以造成成人出現(xiàn)抑郁樣精神行為改變。母愛(ài)剝奪應(yīng)激造成大鼠海馬顆粒層細(xì)胞數(shù)顯著減少，使大鼠腦內(nèi)正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)造成破壞，這可能造成癲癇發(fā)作閾值降低，表現(xiàn)為給予匹魯卡品后潛伏期明顯縮短，癲癇易感性增加。

無(wú)論是抑郁還是癲癇，其發(fā)病機(jī)制都是復(fù)雜的，不是單一機(jī)制可以解釋的，有關(guān)應(yīng)激-抑郁-癲癇的分子生物學(xué)聯(lián)系尚不清楚。我們進(jìn)行本項(xiàng)研究的主要目的就是為了識(shí)別并預(yù)防因早年應(yīng)激而導(dǎo)致的癲癇，但是出生后早期出現(xiàn)抑郁給予抗抑郁治療是否會(huì)使癲癇易發(fā)性增強(qiáng)還不清楚，我們需還要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，來(lái)證實(shí)早年應(yīng)激與癲癇之間是怎樣的具體聯(lián)系，從而達(dá)到預(yù)防癲癇的目的。

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