甄海寧 河井信行 岡田真樹 大久保修一 田宮隆 章翔 劉衛(wèi)平 霍軍麗 費舟

腫瘤細胞的快速生長有賴于活躍的能量代謝和大量的蛋白合成，而蛋白合成則需要充足的氨基酸供給[1]。大型氨基酸轉(zhuǎn)運載體1（large-type amino acid transporter 1,LAT1）和細胞表面抗原4F2重鏈（4F2 heavy chain,4F2hc）可共價結(jié)合形成異源二聚體，以介導(dǎo)分枝型或芳香族必需氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運，LAT1/4F2hc復(fù)合物是一種大型、中性氨基酸的主要轉(zhuǎn)運載體[2]。近年來有關(guān)資料顯示LAT1和4F2hc高表達與人類多種類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。為此，本研究采用免疫組化方法檢測了LAT1和4F2hc在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達狀況，并進一步分析了其表達水平與膠質(zhì)瘤病理級別、惡性程度以及二者表達之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 62例腦膠質(zhì)瘤患者為日本香川大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬醫(yī)院腦神經(jīng)外科自1995年10月至2010年2月收治的病例，男、女各31例，年齡3～89歲，平均（51.4±18.0）歲。腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，按WHO 2007年分類和分級標(biāo)準(zhǔn)，包括Ⅰ級4例，均為毛細胞型星形細胞瘤；Ⅱ級14例，包括彌漫型星形細胞瘤6例，纖維型星形細胞瘤4例，肥胖細胞型星形細胞瘤2例，少突星形細胞瘤1例，室管膜瘤1例；Ⅲ級13例，包括間變型星形細胞瘤12例，間變型室管膜瘤1例；Ⅳ級31例，均為膠質(zhì)母細胞瘤。低惡性度膠質(zhì)瘤（包括Ⅰ級和Ⅱ級）18例，高惡性度膠質(zhì)瘤（包括Ⅲ級和Ⅳ級）44例。蠟塊連續(xù)切片，厚3μm。

1.2 免疫組化方法 采用聚合物-過氧化物酶（PP）免疫組化兩步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，對于LAT1檢測，將切片浸于0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（PH 6.0）中，行微波（500W）抗原修復(fù)10min；對于4F2hc檢測，無需抗原修復(fù)。切片用0.3%H2O2于室溫下孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。用3%牛血清白蛋白（BSA）于室溫下孵育30min，以封閉非特異性結(jié)合位點。一抗稀釋度分別為：LAT1（日本Trans Genic）1:12.5，4F2hc（日本 Trans Genic）1:8。EnVision+/HRP 復(fù)合物液（丹麥Dako）于室溫下孵育40min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染。分別以LAT1和4F2hc表達陽性的肺癌組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 LAT1和4F2hc在瘤細胞中的染色情況參照Nawashiro等[3]的方法，根據(jù)染色細胞百分率和染色強度兩個方面評定為-～+++。即在瘤細胞免疫反應(yīng)最強的區(qū)域，于高倍視野（×400）下計數(shù)1000個細胞，陽性率≤50%為散在性染色，>50%為彌漫性染色。染色強度根據(jù)多數(shù)細胞的反應(yīng)分為陰性、弱染色和強染色。瘤細胞染色分級為：無染色或弱散在性染色（-）、弱彌漫性染色（+）、強散在性染色（++）、強彌漫性染色（+++）。LAT1和4F2hc在血管內(nèi)皮中的染色情況根據(jù)陽性微血管數(shù)（NMV）亦評定為-～+++。即在血管內(nèi)皮免疫反應(yīng)最強的區(qū)域，于高倍鏡（×200）下觀察3～5個視野，其平均NMV≤1為無染色血管（-）、130為豐富的染色血管(+++)。以LAT1和4F2hc在瘤細胞或在微血管中的最高染色等級作為該病例最終的LAT1和4F2hc免疫反應(yīng)評級。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0進行分析，LAT1和4F2hc表達水平與膠質(zhì)瘤病理級別、患者性別和年齡的關(guān)系以及二者表達之間的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析；LAT1和4F2hc在高、低不同惡性程度膠質(zhì)瘤間表達水平的差異采用χ2檢驗。檢測水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LAT1和4F2hc的定性和定位表達 LAT1和4F2hc在62例膠質(zhì)瘤中均有不同程度的表達，其免疫陽性信號既定位于瘤細胞內(nèi)也定位于血管內(nèi)皮；二者在瘤細胞內(nèi)的免疫染色主要位于胞漿和胞質(zhì)膜，少量位于胞核；而在鄰近腫瘤的11例正常腦組織中二者僅有可忽略不計的表達（圖1）。

圖1 LAT1和4F2hc在人腦膠質(zhì)瘤中的表達。A：LAT1在毛細胞型星形細胞瘤（WHOⅠ級）血管內(nèi)皮中弱表達（+）；B：LAT1在肥胖細胞型星形細胞瘤（WHOⅡ級）血管內(nèi)皮中弱表達（+）；C：LAT1在間變型星形細胞瘤（WHOⅢ級）血管內(nèi)皮中中等強度表達以及在瘤細胞胞漿中弱表達（++；D：LAT1在膠質(zhì)母細胞瘤（WHOⅣ級）血管內(nèi)皮中強表達以及在瘤細胞胞漿中中等強度表達（+++）；E：LAT1在膠質(zhì)母細胞瘤（WHOⅣ級）瘤細胞胞漿和血管內(nèi)皮中強表達（+++）；F：LAT1在鄰近腫瘤的正常腦組織中無明顯表達；G：4F2hc在毛細胞型星形細胞瘤（WHOⅠ級）胞漿中弱表達（+）；H：4F2hc在肥胖細胞型星形細胞瘤（WHOⅡ級）瘤細胞胞漿中中等強度表達以及在血管內(nèi)皮中弱表達（++）；I：4F2hc在間變型星形細胞瘤（WHOⅢ級）胞漿和胞質(zhì)膜中強表達（+++）；J：4F2hc在膠質(zhì)母細胞瘤（WHOⅣ級）胞漿和胞質(zhì)膜中強表達以及在血管內(nèi)皮中中等強度表達（+++）；K：4F2hc在膠質(zhì)母細胞瘤（WHOⅣ級）胞漿、胞質(zhì)膜、胞核以及血管內(nèi)皮中強表達（+++）；L：4F2hc在鄰近腫瘤的正常腦組織中無明顯表達。A和G、B和H、C和I、D和J、E和K、F和L分別為同一組織標(biāo)本（×400，標(biāo)尺=20μm）

2.2 LAT1表達與膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系LAT1免疫染色強度隨膠質(zhì)瘤病理級別的升高而明顯增強（rs=0.526,P＜0.01），其在高惡性度膠質(zhì)瘤中的染色強度明顯強于低惡性度膠質(zhì)瘤（χ2=42.456,P＜0.01），見表1。

2.3 4F2hc表達與膠質(zhì)瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系4F2hc免疫染色強度隨膠質(zhì)瘤病理級別的升高而明顯增強（rs=0.413,P＜0.01），其在高惡性度膠質(zhì)瘤中的染色強度明顯強于低惡性度膠質(zhì)瘤（χ2=40.026,P＜0.01），見表1。

表1 LAT1和4F2hc在人腦膠質(zhì)瘤中的表達

2.4 LAT1和4F2hc表達之間的關(guān)系 LAT1和4F2hc表達水平存在明顯正相關(guān)（rs=0.319,P＜0.05）。

3 討論

LAT1和4F2hc分別由SLC7A5（solute carrier family 7 member 5）和SLC3A2基因編碼，二者蛋白產(chǎn)物可以二硫鍵共價結(jié)合形成異源二聚體，即LAT1/4F2hc復(fù)合物，亦稱CD98，是一種大型、中性氨基酸的主要轉(zhuǎn)運載體，可介導(dǎo)多種分枝型或芳香族必需氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、組氨酸等[2]。近年來有關(guān)資料顯示LAT1和4F2hc高表達與人類多種類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4-8]。

LAT1和4F2hc在人膠質(zhì)瘤中的表達研究目前國外僅有個別報道，國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。Nawashiro等[3]采用免疫組化方法檢測60例膠質(zhì)瘤，包括Ⅱ級（纖維型星形細胞瘤）15例，Ⅲ級（間變型星形細胞瘤）17例，Ⅳ級（膠質(zhì)母細胞瘤）28例。結(jié)果顯示LAT1和4F2hc在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中均有表達，而在腫瘤鄰近的正常腦組織中無明顯表達；LAT1表達隨膠質(zhì)瘤病理級別升高而明顯增強，4F2hc表達有隨膠質(zhì)瘤病理級別升高而增強的趨勢。Kobayashi等[9]采用Western blot方法檢測23例膠質(zhì)瘤，結(jié)果顯示LAT1有隨膠質(zhì)瘤惡性度增高而表達增強的趨勢，即在膠質(zhì)母細胞瘤（9/12）和間變型星形細胞瘤（6/8）中其表達陽性率均為75%，而在彌漫型星形細胞瘤中其表達陽性率僅為33%（1/3），且在3例正常腦組織中均無表達；采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法檢測11例膠質(zhì)母細胞瘤和7例間變型星形細胞瘤顯示均有4F2hc mRNA的明顯表達，而在1例正常腦組織和正常的人星形細胞中僅有微弱的表達。本研究結(jié)果與上述研究報道結(jié)果基本一致，也顯示LAT1和4F2hc在腦膠質(zhì)瘤中存在過表達，而在正常腦組織中二者僅有微弱的表達；不僅同樣證實了LAT1表達與膠質(zhì)瘤病理分級密切相關(guān)，而且證實了4F2hc表達也與膠質(zhì)瘤病理分級密切相關(guān)，這提示LAT1和4F2hc共表達與人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展存在密切關(guān)系。

Nawashiro等[3]報道LAT1和4F2hc的免疫陽性信號主要定位于膠質(zhì)瘤細胞的胞質(zhì)膜和胞漿，并未報道二者免疫陽性信號在瘤組織血管內(nèi)皮中的定位。本研究證實LAT1和4F2hc不僅表達于人腦膠質(zhì)瘤瘤細胞內(nèi)，而且表達于腫瘤血管內(nèi)皮。這提示LAT1和4F2hc高表達不僅在從瘤細胞間液向瘤細胞內(nèi)的氨基酸轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用，而且在氨基酸透過血管內(nèi)皮進入腫瘤細胞間質(zhì)過程中同樣發(fā)揮重要作用。以前的有關(guān)研究顯示，LAT1和4F2hc確實表達于小鼠、大鼠和牛等動物腦組織中的血管內(nèi)皮細胞，并指出二者這種表達定位對于介導(dǎo)大型、中性氨基酸穿越血腦屏障（BBB）具有重要意義[10]，以上相關(guān)研究可為本研究結(jié)果提供間接的有力支持。如前文所述，LAT1和4F2hc在本組膠質(zhì)瘤中表達密切相關(guān)，但二者在瘤組織中的表達定位強度并非完全平行一致，即總體而言LAT1在血管內(nèi)皮中的表達要強于瘤細胞，而4F2hc在瘤細胞中的表達要強于血管內(nèi)皮，這提示LAT1和4F2hc表達存在不同的調(diào)節(jié)機制。研究表明，4F2hc共可與6個氨基酸轉(zhuǎn)運載體亞單位共價結(jié)合形成異源二聚體而發(fā)揮包括中性、堿性和酸性多種氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運作用，即除了隸屬L系統(tǒng)的LAT1外，4F2hc還可與L系統(tǒng)的LAT2、y+L系統(tǒng)的y+LAT-1和y+LAT-2、asc系統(tǒng)的asc-1以及xc-系統(tǒng)的xCT（x-C-type transporter）亞單位結(jié)合[2]，這可以解釋4F2hc在瘤細胞中有相對于LAT1更高的表達。而4F2hc在血管內(nèi)皮中的表達相對于LAT1較低，提示這可能是氨基酸穿越血腦屏障的一種限速機制[10]。Nawashiro等[3]報道LAT1免疫陽性信號也少量定位于瘤細胞胞核，但作者分析這是染色造成的偽影所致。本研究顯示LAT1和4F2hc免疫染色在瘤細胞中的確主要定位于胞質(zhì)和胞質(zhì)膜，但也少量定位于瘤細胞胞核。我們認為LAT1和4F2hc在瘤細胞胞核中的著色是特異性的，但其作用機制尚需進一步深入研究。

總之，本研究結(jié)果提示LAT1和4F2hc在人腦膠質(zhì)瘤中存在過表達，并且其高表達與膠質(zhì)瘤的病理分級和惡性程度密切相關(guān)，二者在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用機制值得進一步深入研究。

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