王秀麗，毛開榮，程君生，張立春，丁家波，蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的一種危害嚴重的人畜共患傳染性變態(tài)反應疾病[1]，在世界上160多個國家和地區(qū)流行，給世界養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[2]，并給世界公共衛(wèi)生造成很大的威脅。其中牛種布魯氏菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失最大，而威脅人類健康最嚴重的是羊種布魯氏菌，它可以穿透完整的皮膚對人造成感染，因此防控羊布魯氏菌病不僅有重要的經(jīng)濟意義，還具有重大的公共衛(wèi)生意義。目前為止沒有一種診斷羊布氏菌病的標準方法。本研究旨在建立檢測羊布氏菌病的iELISA方法，為我國羊布魯氏菌病的檢測提供新方法。

1 材料與方法

1.1 主要菌種和試劑

1.1.1 菌種 羊種布魯氏菌16M(CVCC 70002)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏室保存。

1.1.2 試劑 明膠、辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG抗體，Sigma公司;脫脂奶粉，B.D.公司;TMB，NUPU公司;試管凝集抗原、虎紅平板凝集試驗抗原，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 血清 陽性參照血清、陰性參照血清由本實驗室制備;血清樣本1，共385份，由山東農(nóng)業(yè)大學和哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，用于臨界值的確定和符合率試驗;血清樣本2，共1932份，由內(nèi)蒙古動物疫病預防控制中心提供，用于臨床試驗;綿羊小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9、大腸桿菌O157、都柏林沙門氏菌陽性血清由本實驗室制備，用于iELISA特異性檢驗;雞血清、兔血清由本實驗室制備，用于封閉液的篩選。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 將純粹檢驗合格的羊種布魯氏菌16M株菌種劃線接種于胰示瓊脂扁瓶，37℃培養(yǎng)48 h后，用適量0.5%石炭酸生理鹽水洗下菌體，80℃滅活2 h;9000 g離心10 min，收集菌體。參照OIE手冊[3]用熱酚水法提取脂多糖(LPS)抗原。

提取的LPS經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和SAS-PAGE檢測核酸和蛋白的殘留量，若存在核酸，加入終濃度為15 μg/mL的核酸酶，37℃水浴3 h，若存在蛋白則加入終濃度為15 μg/mL的蛋白酶K，55℃水浴3 h，37℃水浴24 h，收集處理產(chǎn)物，用蒸餾水透析，4000 mL/次，透析3次。

純化的LPS經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE鑒定LPS的純度。并用銀氨染色法鑒定LPS。將LPS抗原搖勻，用微量移液器準確分裝，2 mL/瓶，凍干，稱重，測定每瓶LPS抗原的質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 iELISA方法的建立

1.2.2.1 抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)的確定 抗原用0.01 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)系列稀釋后100 μL/孔包被酶標板，4℃過夜，用 200 μL/孔 PBST 洗板 4 次，5 min/次;洗板后加入200 μL/孔5%的脫脂奶粉，37℃封閉1 h，用200 μL/孔 PBST洗板4次，5 min/次，然后加入經(jīng)系列稀釋的陰陽性對照血清方陣滴定，37℃孵育1 h，用200 μL/孔PBST洗板4次，5 min/次;按照酶標二抗說明書加入1∶40000倍稀釋的HRP標記兔抗羊IgG 抗 體 100 μL/孔，37 ℃ 孵 育 1 h，用200 μL/孔 PBST 洗板4 次，5 min/次;加入100 μL/孔TMB顯色液室溫下(25℃)避光顯色10 min;按50 μL/孔加入1 mol/L的 H2SO4終止反應，測 OD450nm值。

按照上述程序，將抗原和待檢血清分別進行系列稀釋(待檢血清起始稀釋倍數(shù)為50，以后2倍系列稀釋至1∶400，抗原起始稀釋倍數(shù)為1∶100，2倍系列稀釋至1∶6400)，后進行方陣滴定，確定合適的抗原濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)，根據(jù)抗原的質(zhì)量計算出抗原的包被濃度。

1.2.2.2 反應條件的優(yōu)化 確定最佳抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)后，按照控制單一變量法比較0.2%的脫脂乳、2%脫脂乳、10%脫脂乳、0.4%明膠、5%雞血清、5%兔血清的封閉效果，比較封閉37 ℃孵育 90、60、30、20、10 min，4 ℃12 h 的差異;比較待檢血清在 37 ℃ 孵育 90、60、30、20、10 min和4℃過夜不同孵育時間的差異;比較HRP標記兔抗羊 IgG抗體稀釋1∶10000、1∶20000、1∶40000、1∶80000、1∶160000 倍，在 37℃孵育 90、60、30、20、10 min 的差異;比較顯色液室溫(25 ℃)作用 3、5、8、10、15 min的顯色情況，最終篩選出最佳的反應條件，確定該系統(tǒng)的最終反應程序。

1.2.2.3 臨界值的確定 將血清樣本1進行SAT和RBPT檢測，將SAT和RBPT均為陽性的血清作為陽性血清樣本，SAT和RBPT均為陰性的血清作為陰性血清樣本。將所有的樣本用所建立的iELISA進行檢測，根據(jù)結(jié)果計算陽性樣本和陰性樣本的平均值，求S/P值[S/P=(樣本值-陰性均值)/(陽性均值 -陰性均值)]。檢測結(jié)果用MedCalc軟件進行ROC曲線分析，取敏感性與特異性之和最高的S/P值為陽性和陰性結(jié)果的臨界值。

1.2.2.4 對照血清的制備 陰性對照血清的制備將RBPT、SAT、補體結(jié)合試驗(CFT)檢測結(jié)果均為布魯氏菌抗體陰性的綿羊血清作為陰性對照血清，通過對大量羊布魯氏菌病陰性血清樣本iELISA檢測結(jié)果的統(tǒng)計，陰性對照血清iELISA檢測結(jié)果OD450nm控制在統(tǒng)計結(jié)果的陰性平均值以下。

陽性對照血清的制備通過RBPT篩選布魯氏菌病抗體陰性的健康綿羊，用羊種布魯氏菌16M株培養(yǎng)物比濁至10億CFU/mL作為活菌免疫用抗原，羊布魯氏菌16M株培養(yǎng)物80～90℃滅活，比濁至10億CFU/mL作為死菌免疫抗原，按以下程序免疫綿羊:活菌免疫原2 mL腿部皮下注射免疫，21 d，重復相同的抗原和免疫途徑注射4 mL抗原，28 d后采用同樣注射途徑注射4 mL死菌免疫抗原加強免疫，14 d后采血，通過SAT檢測抗體效價。

人工感染制備的強陽性血清用陰性對照血清做2倍系列稀釋，進行 iELISA檢測，強陽性對照OD450nm值控制在大量陽性血清樣本iELISA檢測結(jié)果的平均值以上，弱陽性對照血清控制在結(jié)果判定的臨界值以上，并且在強陽性對照血清OD450nm值以下。

1.2.3 敏感性、特異性、重復性、穩(wěn)定性、符合率試驗

1.2.3.1 敏感性試驗 對5份臨床陽性血清(來源于血清樣本1)和強陽性對照血清、弱陽性對照血清分別用血清稀釋液做2倍系列稀釋，用所建立的iELISA方法進行檢測，同時對稀釋的血清用虎紅平板凝集試驗(RBPT)和平板凝集試驗(SAT)檢測，記錄判定結(jié)果，比較三種方法的敏感性。

1.2.3.2 特異性試驗 對綿羊布魯氏菌病的陽性血清、陰性血清、都柏林沙門氏菌陽性血清、大腸桿菌O157陽性血清和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽性血清用建立的iELISA方法進行檢測，驗證所建立方法的特異性。

1.2.3.3 重復性試驗隨機選擇20110524、20110608、20110611三批包被的酶標板各一塊，每塊板均對上述16份血清進行檢測，計算三批包被酶標板檢測同一份血清OD450nm的變異系數(shù)，分析批間重復性效果。選擇20110611批包被的5塊酶標板，每塊板均對16份血清(來源于血清樣本1)進行檢測，計算同一批包被的不同酶標板檢測同一份血清OD450nm的變異系數(shù)，分析批內(nèi)重復性效果。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 將包被好的酶標板于4℃保存，分別在保存期為2、3、4、7、11 個月時對 16 份血清進行檢測，判定包被好的酶標板的穩(wěn)定性。

1.2.3.5 符合率試驗 用建立的iELISA及RBPT、SAT對血清樣本1進行檢測，計算該iELISA與RBPT、SAT檢測結(jié)果的符合率。

1.2.4 臨床樣品的檢測 對血清樣本2進行iELISA和RBPT檢測，統(tǒng)計iELISA與RBPT檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 抗原的制備 參照OIE手冊提取的LPS進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測不到核酸條帶，表明提取物中不含核酸，進行SDS-PAGE證明提取物中有蛋白存在，對此提純抗原加入終濃度為15 μg/mL的蛋白酶K消化，將消化產(chǎn)物透析后，進行SDS-PAGE，結(jié)果表明，經(jīng)蛋白酶消化處理后的LPS已經(jīng)不含蛋白(圖1)。對純化的LPS進行銀氨染色，結(jié)果表明蛋白酶K消化和透析等處理對LPS沒有影響(圖2)。最后凍干。凍干后隨機抽取5瓶稱重，LPS的質(zhì)量為1032 ±3 μg/瓶。

圖1 LPS經(jīng)蛋白酶K消化前后的SDS-PAGE圖

圖2 LPS透析前后的銀染圖

2.2 iELISA方法的建立

2.2.1 抗原最佳包被濃度和待檢血清最佳稀釋度的確定 抗原和待檢血清方陣滴定結(jié)果表明，抗原包被濃度越高，血清稀釋倍數(shù)越低，非特異性反應越強，反之則越弱，而陰性血清稀釋倍數(shù)太大將失去意義。最終確定抗原的稀釋倍數(shù)為1∶3200，據(jù)此計算出LPS抗原的包被濃度為0.16 μg/mL，血清的稀釋倍數(shù)為1∶100。

2.2.2 最佳工作條件的確定 按控制單一變量法對封閉液、封閉時間，待檢血清孵育時間，酶標記兔抗羊IgG抗體最佳稀釋度、孵育時間，顯色時間進行優(yōu)化。結(jié)果表明0.4%的明膠37℃封閉30 min的封閉效果最佳;待檢血清孵育條件為37℃孵育10 min;酶標記兔抗羊IgG抗體最佳工作濃度為1∶40000;最佳孵育條件為37℃，30 min;最佳顯色條件為25℃，10 min。

2.2.3 臨界值的確定 對血清樣本1中SAT和RBPT檢測結(jié)果一致(SAT和RBPT同為陽性或SAT和RBPT同為陰性)的血清樣本通過iELISA檢測，陽性血清樣本平均OD450mm為0.83，陰性血清樣本平均OD450mm為0.15，經(jīng)ROC曲線分析，當 S/P=0.2時，敏感性為98.41%，特異性為96.65%，見表1，ROC曲線的下面積為(AUC)為0.997，說明該診斷方法效果良好(圖3)。

表1 iELISA檢測羊血清不同的臨界值對應的統(tǒng)計數(shù)據(jù)

圖3 ROC曲線

2.2.4 對照血清的制備及標準的確定 依據(jù)來自不同地區(qū)385份血清樣本的統(tǒng)計結(jié)果，陰性對照血清控制在陰性樣本統(tǒng)計結(jié)果的平均值以下(OD450nm≤0.15)，強陽性對照OD450nm的值控制在陽性樣本統(tǒng)計結(jié)果的平均值以上(OD450nm≥0.83)，弱陽性血清控制在臨界值以上(0.35≤OD450nm≤0.70)，并以此作為iELISA試驗成立的條件。

將人工感染制備的布魯氏菌強陽性血清2倍系列稀釋，通過此iELISA檢測結(jié)果顯示，陰性對照血清OD450nm值為0.15，可選擇此次檢測的陰性血清;強陽性血清(S2)用陰性血清稀釋2倍后OD450nm值為0.931，作強陽性對照血清;強陽性血清(S2)用陰性血清稀釋16倍后OD450nm值為0.381，作弱陽性對照血清。

2.3 敏感性、特異性、重復性、穩(wěn)定性、符合率試驗結(jié)果

2.3.1 敏感性試驗 將5份陽性血清和強陽性對照血清、弱陽性對照血清、分別用血清稀釋液做2倍系列稀釋(2-1～2-12)，用所建立的iELISA方法進行檢測。結(jié)果顯示，當血清稀釋到256倍時全部為陽性，有的稀釋到1024倍時仍能檢測出來，強陽性參照血清稀釋2048倍時仍可判定為陽性，弱陽性血清稀釋128倍時判為陽性。iELISA比RBPT、SAT敏感性高，結(jié)果見表2。

表2 SAT、RBPT、iELISA敏感性比較

2.3.2 特異性試驗 對綿羊布魯氏菌病的陽性血清、陰性血清、都柏林沙門氏菌陽性血清、大腸桿菌O157陽性血清和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽性血清用建立的iELISA方法進行檢測，結(jié)果顯示布魯氏菌陽性血清和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽性血清檢測結(jié)果為陽性，而布魯氏菌陰性血清、大腸桿菌O157陽性血清、都柏林沙門氏菌陽性血清iELISA檢測結(jié)果均為陰性(表3)。

表3 特異性試驗結(jié)果比較

2.3.3 重復性試驗 用20110524批、20110608批、20110611批包被的3批酶標板對上述16份血清檢測結(jié)果顯示，批間變異系數(shù)在1.1% ～9.8%之間，說明批間重復性良好;用20110611批包被的5塊酶標板對16份血清檢測結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在2.9%～9.8%之間，說明批內(nèi)重復性良好。批間重復性試驗和批內(nèi)重復性試驗結(jié)果符合臨床檢測要求。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 將包被好的酶標板于2～8℃保存，分別在保存期為 2、3、4、7、11 個月時對16 份血清檢測結(jié)果顯示，在11個月內(nèi)包被酶標板檢測結(jié)果穩(wěn)定。

2.3.5 符合率試驗 對來自泰安、濟南、哈爾濱的385份血清分別用虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗和iELISA進行檢測。結(jié)果顯示，iELISA與SAT的陽性符合率為88.57%，陰性符合率為98.21%;iELISA與RBPT的陽性符合率為97.44%，陰性符合率為91.86%;若以SAT和RBPT結(jié)果一致為判定標準，則陽性符合率為95.24%，陰性符合率為96.28%;若以SAT或RBPT檢測結(jié)果陽性判為陽性血清，SAT或RBPT檢測結(jié)果陰性判定為陰性血清，則陽性符合率為93.63%，陰性符合率為96.62%(表4)。

表4 SAT和RBPT與iELISA的符合率情況

2.4 臨床樣品的檢測 用本研究所建立的iELISA方法對血清樣本2進行了檢測，并與RBPT的檢測結(jié)果進行了比較。其中RBPT陽性血清161份，iELISA檢出157份，與RBPT的陽性符合率為97.5%，RBPT陰性血清1771份，iELISA檢出1614份，陰性符合率為91.1%，總符合率為91.7%。

3 討論與小結(jié)

研究以純化的布魯氏菌LPS為包被抗原，建立了檢測羊布魯氏菌病的iELISA方法。試驗結(jié)果表明，此方法抗原用量低，包被濃度僅為0.16 μg/mL，降低了檢測成本;對大量臨床樣品的檢測以及與RBPT、SAT檢測結(jié)果比較，iELISA具有較高的敏感性;特異性試驗證明該方法可以有效排除布魯氏菌與大腸桿菌O157和都柏林沙門氏菌的交叉感染，特異性良好;符合率試驗證明iELISA與SAT和RBPT的符合率大于90%;批內(nèi)重復性試驗和批間重復性試驗變異系數(shù)均小于10%，表明該檢測方法具有良好的可重復性;保存期試驗證明在1年之內(nèi)，包被酶標板的檢測結(jié)果穩(wěn)定;經(jīng)過不同條件的優(yōu)化，該檢測的整個過程只需要1 h，一次可檢測大量的臨床樣品，比以往的iELISA檢測方法更加省時。

iELISA的符合率試驗顯示，RBPT、SAT、iELISA檢測結(jié)果有時不完全一致，這與布魯氏菌感染后不同時期產(chǎn)生抗體類型的差異有關，布魯氏菌感染初期誘導產(chǎn)生的抗體主要是IgA和IgM，凝集反應很強，而本研究所建立的iELISA檢測抗體為IgG。布魯氏菌的分離鑒定雖然是布魯氏菌病診斷的金標準，但是布魯氏菌的分離效率比較低，感染的大部分時期分離不到菌體，所以確診布魯氏菌病的方法有待進一步研究。

由于該檢測方法選擇的抗原是光滑型布魯氏菌的LPS，粗糙型抗體與之不發(fā)生反應，且特異性試驗結(jié)果顯示iELISA不能有效區(qū)分小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9與布魯氏菌的LPS-IgG抗體，為解決以上問題，選擇一種能引起較強體液免疫反應的布魯氏菌共同蛋白作為抗原建立方法是將來研究的重要方向。據(jù)文獻報道，OMP28蛋白的抗原性良好[4-6]，但與其他的檢測方法一樣，該方法不能區(qū)分野毒感染和布魯氏菌疫苗免疫產(chǎn)生的抗體，解決該問題寄希望于基因缺失疫苗株的構建以及相應的亞單位疫苗的研究。

目前用于布魯氏菌病的診斷方法主要有(RBPT，SAT等傳統(tǒng)血清學診斷方法。隨著分子生物學的發(fā)展，PCR 技術[7-9]、核酸探針技術[10]等應用于布魯氏菌抗原的診斷。ELISA[11-12]、熒光偏振技術[13]、免疫酶組化技術[14]、膠體金標記[15-16]等免疫學技術應用于布魯氏菌病抗體檢測的研究日益增多。但這些檢測方法或者接觸活菌，存在生物安全隱患;或者靈敏度低，存在漏檢的風險，不利于布魯氏菌病的凈化;或者需要特定的儀器設備和專業(yè)的技術人員，難以在基層推廣應用。本研究建立的iELISA方法操作方便，靈敏度和特異性均較高，省時省力，對檢驗人員專業(yè)素質(zhì)的要求不高，方便在臨床推廣應用，具有良好的應用前景。

[1]Pappas G，Papadimitriou P，Christou L，et al.Future trends in human brucellosis treatment[J].Expert Opin Invest Drugs.2006，15(10):1141-1149.

[2]Chain P，Comerci D J，Tolmasky M E，et al.Whole-genome analysis of speciation events in pathogenic brucella[J].Infect Immun，2005，73(12):8353-8361.

[3]Office International Des Epizooties，OIE terrestrial manual[M].World Organization for Animal Health，2009:15-16.

[4]Michel S Z，Sylvie B，Niees V，et al.Single step purification and evaluation of recombinant BP26 protein for serological diagnosisof Brucella ovis infection in rams[J].Vet Microbio，2002，87:213-220.

[5]Pallab C，Rajeev P，Vinth K，et al.Recombinant OMP28 antigenbased indirect ELISA for serodiagnosis of bovine brucellosis[J].Molecular and Cellular Prubes ，2010，24:142-145.

[6]Gupta V K，Ranjeeta K，Jyoti V，et al.Comparative evaluation of recombinant BP26 protein for serological diagnosis of Brucella melitensis infection in goats[J].Small Ruminant Resarch，2010，93:119-125.

[7]Ouahrani-Bettache S，Soubrier M P，Liautard J.P.IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains[J].J of Applied Bacteriology，1996，81:154-160.

[8]Bricker B J，Evalt D R，Olsen S G，et al.Evaluation of the B．a(chǎn)bortus species-specific polymerase chain reaction assay，an improved version of the Brucella AMOS-polymerase-chain-reaction assay for cattle[J].Vet Diagn Invest，2003，15(4):374-378.

[9]Mater GM，KhneisserI A，Abdehoor A M.Rapid laboratory conformation of human Brucella by PCR analysis of a target sequence on the 31kibdalton Brucella Antigen DNA[J].Clinical Microbiol，1996，34(2):477-478.

[10]Farnander-Lago L，Vallejo F J，Trujilano L，et al.Fluorecent Whole-cell hydridization with 16S rRNA-Targeted oligonucleitide probes to identifie Brucella spp.by flow Cytomaty[J].J of Clinical Microbio，2002，38(7):2768-2771.

[11]Funk N D，Tabatabai L B，Elzer P H，et al.Indirect enzymelinked immunosorbent assay for detection of Brucella melitensisspecific Antibodies in Goat Milk[J].J of Clinical Microbio，2005，F(xiàn)eb，721-725.

[12]Nielsen K，Smith P，Yu W L，et al.Validation of a second generation comparative enzyme immunoassay(CELISA)for the diagnosis of brucellosis in various species of domestic animals[J].Vet Immunol Immunopathol，2008，125(3/4):246-250.

[13]Nielsen K，Gall D，Jolley M，et al.A Homogeneous flourescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus．[J].Immunol Methods，1996，95(1/2):161-168.

[14]Kim J W，LeeY J，Han M Y，et al.Evaluation of immunochromatographic assay for serodiagnosis of Brucella canis[J].J of Vet Med Sci，2007，69(11):1103-1107.

[15]朱明東，洪林娣.快速免疫診斷布魯氏菌病新方法的研究[J].浙江省醫(yī)學科學院學報，2006，67(8):14-17.

[16]朱明東，洪林娣.膠體金免疫層析法快速診斷牛布魯氏菌病的研究[J].中國人獸共患病學報，2008，24(8):755-759.