張?zhí)N哲，馬雯，李聰，李森，袁耀武

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

0 引 言

在酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）中，包被環(huán)節(jié)是影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性及可重復(fù)性的關(guān)鍵因素之一。目前，一些非蛋白類小分子半抗原的包被通常先與蛋白載體共價(jià)聯(lián)接制備偶聯(lián)物[1-6]，過程繁瑣。小分子半抗原還可以采用另外一種包被方式，即半抗原自身基團(tuán)簡(jiǎn)單修飾后直接與氨基化或醛基化的酶標(biāo)板通過化學(xué)鍵聯(lián)接達(dá)到包被目的[7-10]，過程較為簡(jiǎn)單，而且可以排除載體蛋白引起交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，目前這種包被方式在文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中相對(duì)較少。本研究將氯霉素半抗原采用上述兩種不同方式包被酶標(biāo)板，利用間接ELISA測(cè)定鮮牛乳中氯霉素質(zhì)量濃度，并對(duì)兩種不同包被方式的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析比較，從而對(duì)氯霉素半抗原包被方式在實(shí)際樣品測(cè)定中的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

卵清蛋白OVA，氯霉素，氨基己酸，抗氯霉素氯抗體，各濃度氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，酶標(biāo)記物，樣品復(fù)溶液來自氯霉素快速檢測(cè)試劑盒，JET BIOFIL酶標(biāo)板，亞硝基鐵氰化鈉，乙酸乙酯，鋅粉，硫酸鋅，無水乙醇，鮮牛乳，電熱恒溫培養(yǎng)箱，離心機(jī)，酶標(biāo)儀。

以下溶液本實(shí)驗(yàn)室配置：磷酸鹽緩沖液PBS（pH＝7.4）；洗滌液 PBST（pH＝7.4）；碳酸鹽緩沖液 CBS（pH＝9.6）；底物溶液（OPD-過氧化氫溶液）；終止液（濃度2.0m o l/L的H2SO4溶液）。

1.2 方法

1.2.1 氯霉素半抗原的直接包被方式

氨基化氯霉素的制備、酶標(biāo)板醛基化處理參照文獻(xiàn)[8]中的方法進(jìn)行。

酶標(biāo)板的包被：將氨基化氯霉素用PBS適當(dāng)稀釋后加入醛基化酶標(biāo)板，150μL/孔，37℃恒溫反應(yīng)2 h，之后PBST洗滌3次，250μL/孔PBST洗液，每次3分鐘。

酶標(biāo)板的封閉：用0.2 m ol/L的氨基己酸溶液封閉酶標(biāo)板，200μL/孔，37℃恒溫反應(yīng)2 h，之后PBST如上洗滌3次。

1.2.2 氯霉素半抗原的間接包被方式

氯霉素-OVA偶聯(lián)蛋白的制備：混合酸酐法，參照文獻(xiàn)[1]中方法。

酶標(biāo)板的包被：將氯霉素-OVA偶連蛋白用CBS適當(dāng)稀釋后加入酶標(biāo)板，150μL/孔，37℃恒溫反應(yīng)2 h，之后PBST洗滌3次，250μL/孔PBST洗液，每次3 min。

酶標(biāo)板的封閉：用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的OVA的PBS溶液封閉酶標(biāo)板，200μL/孔，37℃恒溫反應(yīng)2 h，之后PBST如上洗滌3次。

1.2.3 兩種不同包被方式包被濃度的確定

在直接包被方式中，將氨基化氯霉素制備液用PBS溶液5倍遞進(jìn)稀釋為不同質(zhì)量濃度后，按照1.2.1步驟分別包被醛基化酶標(biāo)板并完成封閉過程；在間接包被方式中，將氯霉素-OVA偶連蛋白制備液用CBS溶液5倍遞進(jìn)稀釋為不同濃度后，按照1.2.2步驟分別包被酶標(biāo)板并完成封閉過程。不同包被濃度的孔中分別加入50μL的酶標(biāo)記物、50μL的PBS溶液及50μL的氯霉素抗體工作液，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，保濕反應(yīng)30 min；甩凈孔內(nèi)液體后按照1.2.1步驟洗板5次；向所有孔中加入底物溶液100μL，25℃避光反應(yīng)15 min；向所有孔內(nèi)加終止溶液50μL；用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。繪制吸光度與包被濃度關(guān)系曲線，通過分析比較，確定兩種包被方式的抗原包被質(zhì)量濃度。

1.2.4 含氯霉素牛乳樣品的制備及提取

含氯霉素牛乳樣品的制備：取新鮮牛乳，人為添加氯霉素，使其在牛乳中質(zhì)量濃度分別為0.05，0.2，0.8 μg/L，充分混勻。

含氯霉素牛乳樣品的提?。悍謩e量取5.0 m L添加不同質(zhì)量濃度氯霉素的牛乳樣品及對(duì)照牛乳，加入0.25 m L濃度為0.36 mol/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和0.25 m L濃度為1m o l/L硫酸鋅溶液，震蕩混合，然后在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心10 min。避開上層油脂，移取出2.2m L的上層液至另一離心管，加入4m L的乙酸乙酯，充分震蕩5 min，然后轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心10 min。吸取上層液體2 m L，在60℃氮?dú)饬飨麓蹈?，? m L樣品復(fù)溶液溶解干燥后的殘留物，待檢用。

1.2.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定樣品中氯霉素

在確定好包被濃度的兩種不同包被方式的酶標(biāo)板中，分別取不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液及待測(cè)樣品提取液各50μL，加到酶標(biāo)板對(duì)應(yīng)孔中，各孔中加入50μL的酶標(biāo)記物，然后各孔中加入50μL的抗體工作液，后續(xù)反應(yīng)步驟同于1.2.3。標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定吸光度值后分析重復(fù)孔吸光度值變異系數(shù)，計(jì)算百分吸光度值（百分吸光度值=B/B0×100%，B代表各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值，B0代表氯霉素0含量準(zhǔn)溶液的吸光度值），繪制百分吸光度值與氯霉素質(zhì)量濃度關(guān)系的回歸曲線。待測(cè)樣品計(jì)算百分吸光度值后根據(jù)回歸曲線確定牛乳樣品中氯霉素含量，并計(jì)算各濃度樣品氯霉素回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種不同包被方式包被濃度的確定

兩種不同包被方式的間接ELISA，在抗體與酶標(biāo)記物濃度一定的情況下，包被抗原濃度與結(jié)果吸光度值的關(guān)系見圖1。由圖1可以看出隨著包被抗原稀釋度的增加，兩種包被方式的吸光度值都呈現(xiàn)規(guī)律性下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出平緩—速降—平緩的過程。曲線的速降區(qū)為與抗體反應(yīng)合理的抗原濃度范圍，本試驗(yàn)在速降區(qū)中部左右選擇吸光度值，兩種不同包被方式與此吸光度值對(duì)應(yīng)的稀釋度作為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的包被濃度，即直接包被方式采用1：625倍稀釋的制備液，間接包被方式采用1：25倍稀釋制備液，它們對(duì)應(yīng)的吸光度值均為1左右。

圖1 包被濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.2 兩種不同包被方式孔間變異系數(shù)的比較

不同質(zhì)量濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定后，測(cè)定吸光度值并分析各濃度重復(fù)孔吸光度值的變異系數(shù)，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，兩種包被方式各濃度標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值變異系數(shù)在2.6～10.6之間，都屬于正常范圍以內(nèi)（小于15%），經(jīng)無重復(fù)雙因素方差分析對(duì)吸光度值變異系數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種包被方式間比較P-value值為0.039，在0.01～0.05之間，差異顯著；各濃度組間比較P-value值遠(yuǎn)小于0.01，差異極顯著。結(jié)果說明變異系數(shù)受到包被方式的影響，也受到樣品中氯霉素質(zhì)量濃度的影響，與間接包被方式相比，直接包被方式具有更低的變異系數(shù)。

表1 不同包被方式吸光度值變異系數(shù)的比較

2.3 兩種不同包被方式回歸曲線的比較

不同質(zhì)量濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定后，繪制百分吸光度值（B/B0）%與氯霉素質(zhì)量濃度關(guān)系的回歸曲線，如圖2所示。由圖2可以看出，兩種包被方式的回歸曲線都呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，這說明不論哪種包被方式，在通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定氯霉素質(zhì)量濃度時(shí)都是可行的。兩種包被方式中，百分吸光度值隨著氯霉素質(zhì)量濃度在0.025～2.025μg/L之間變化均呈現(xiàn)規(guī)律性下降趨勢(shì)，在0.075～0.675μg/L之間下降坡度最大，提示這個(gè)濃度區(qū)段是樣品中抗原最佳競(jìng)爭(zhēng)質(zhì)量濃度范圍。直接包被方式與間接包被方式相比，曲線末端出現(xiàn)明顯向下背離趨勢(shì)，意味著直接包被方式的回歸曲線具有更大斜率，量效關(guān)系更明顯，從理論上講檢測(cè)靈敏度要高于間接包被方式，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因還需進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

圖2 不同包被方式的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定氯霉素回歸曲線的比較

2.4 兩種不同包被方式檢測(cè)結(jié)果的比較

添加不同質(zhì)量濃度氯霉素的牛乳樣品經(jīng)過提取后，利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定各樣品的吸光度值，計(jì)算B/B0（%）后，根據(jù)回歸曲線得出氯霉素檢出量，結(jié)果如表2所示。經(jīng)單因素方差分析，各處理組兩種包被方式氯霉素檢出量比較P-value值均大于0.05，即無顯著性差異。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算樣品回收率，直接包被方式各處理組樣品回收率在80.9～91之間，間接包被方式各處理組樣品回收率在85.9～94之間，經(jīng)無重復(fù)雙因素方差分析，兩種包被方式樣品回收率結(jié)果無顯著性差異，各處理組間樣品回收率結(jié)果也無顯著性差異。

表2 不同包被方式的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)牛乳樣品中氯霉素檢測(cè)結(jié)果的比較

3 討論

氯霉素是家畜疾病防治的常用藥物，如果氯霉素殘留物隨動(dòng)物性食品進(jìn)入人體中，會(huì)對(duì)人類健康帶來潛在危害。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)可以快速檢測(cè)樣品中氯霉素的殘留，而包被環(huán)節(jié)又是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。本研究在利用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)氯霉素時(shí)，對(duì)氯霉素半抗原的兩種包被方式進(jìn)行了對(duì)比分析。間接包被方式需要先制備蛋白偶聯(lián)物，過程較繁瑣；直接包被方式與間接包被方式相比，制備過程較為簡(jiǎn)單。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，直接包被方式在回歸曲線具有更大斜率，重復(fù)孔吸光度值的變異系數(shù)也相對(duì)較低，兩種包被方式在牛乳樣品中的氯霉素檢出量及測(cè)得樣品回收率方面并沒有顯著性差異，結(jié)果說明直接包被方式可以得到穩(wěn)定的包被效果，能夠用于乳類樣品中氯霉素的檢測(cè)。