口蹄疫滅活疫苗中蛋白質(zhì)含量測定方法的比較

馬 麗，鄒興啟，朱元源，史蘭廣，趙啟祖*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081;2.北京科興生物制品有限公司，北京100085)

口蹄疫滅活疫苗中主要成分為抗原和佐劑，純化不完全的疫苗中可能會含有細胞碎片、血清、病毒非結(jié)構(gòu)蛋白等雜蛋白，使用過程中會引發(fā)動物副反應(yīng)，同時疫苗中病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的存在給病毒感染和疫苗免疫的鑒別診斷帶來困難[1-2]。因此，選擇一種適合、簡便、快速、靈敏的蛋白質(zhì)含量測定方法來準確定量口蹄疫滅活疫苗中蛋白質(zhì)對于疫苗的質(zhì)量監(jiān)控意義重大。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有多種，包括凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法、考馬斯亮藍法、2，2’-聯(lián)喹啉-4，4’-二羧酸法和紫外分光光度法等[3]。本試驗采用凱氏定氮法、改良Lowry法和考馬斯亮藍法這三種較常見的測定方法，測定抽取樣品的蛋白質(zhì)含量，并對之進行比較，最后采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進一步驗證測定結(jié)果，以期為口蹄疫滅活疫苗蛋白質(zhì)含量檢測方法的遴選和標準化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 KjeltecTM2300自動定氮儀(FOSS公司產(chǎn)品)，紫外分光光度計(Thermo公司產(chǎn)品)，蛋白質(zhì)電泳儀，渦旋混合器，離心機(SIGMA公司產(chǎn)品)，“U”型96孔板，各量程移液槍。

1.2 試劑 催化劑片(FOSS公司產(chǎn)品)，濃硫酸，雙氧水，12%PAGE膠(invitrogen公司產(chǎn)品)，丙酮，改良Lowry法蛋白質(zhì)測定試劑盒(Thermo公司產(chǎn)品)，考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)測定試劑盒(Thermo公司產(chǎn)品)。

1.3 檢測樣品 國內(nèi)不同口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)廠家抽取的15批次口蹄疫O型、亞洲1型二價滅活疫苗。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備 破乳樣品制備:準確量取10 mL疫苗樣品，加1.1 mL正丁醇，充分混勻，4℃靜置過夜，取下層清亮液體，即為破乳樣品。

檢測樣品制備:準確量取100 μL疫苗樣品，加900 μL丙酮，充分混勻，室溫靜置 10 min，4 ℃，15000 g，離心15 min，棄上清，丙酮洗沉淀兩次，室溫干燥沉淀，用適量去離子水重懸沉淀[4-5]。

標準牛血清白蛋白系列濃度樣品制備:將試劑盒內(nèi)標準牛血清白蛋白(2 mg/mL)，用去離子水稀釋成終濃度為 0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 μg/mL 樣品，備用。

1.4.2 凱氏定氮法 以生理鹽水為空白對照，按KjeltecTM2300自動定氮儀使用操作規(guī)程對破乳樣品定氮。準確量取1 mL樣品加入消化管，同時加入半片催化劑片、5 mL濃硫酸、2.5 mL雙氧水，置消化爐上，420℃消化1 h，冷卻至室溫，將樣品置全自動凱氏定氮儀上定氮，測定氮含量，乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.25，即得1 mL樣品蛋白質(zhì)含量，每一樣品平行測定三次，取平均值。

1.4.3 改良Lowry法標準曲線繪制 按改良Lowry法蛋白質(zhì)測定試劑盒說明書操作，準確量取標準牛血清白蛋白系列濃度樣品各40 μL，加入“U”型96孔板中，加入試劑盒內(nèi)Lowry試劑200 μL，室溫放置10 min，加入酚試劑 20 μL，室溫放置 30 min，測定各濃度在750 nm吸光值。

1.4.4 考馬斯亮藍法標準曲線繪制 按考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)測定試劑盒說明書操作，準確量取標準牛血清白蛋白系列濃度樣品各取10 μL，加入“U”型96孔板中，加入試劑盒內(nèi)考馬斯亮藍溶液300 μL，室溫放置10 min，測定各濃度在595 nm吸光值。

1.4.5 改良Lowry法和考馬斯亮藍法比較試驗改良Lowry法和考馬斯亮藍法檢測范圍分別為1～1500 μg/mL 和100 ～1500 μg/mL，為了驗證樣品中蛋白質(zhì)含量對測定結(jié)果影響，從15批疫苗中選取6批疫苗:1號、2號、6號、7號、8號、14號，這6批疫苗分別來自6個口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)廠，分別測定其原倍、5倍和10倍稀釋后蛋白質(zhì)含量。

1.4.6 SDS-PAGE 按純化樣品制備方法得15批疫苗沉淀，再用20 μL上樣緩沖液重懸沉淀，參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》[4]進行 SDS-PAGE:使用12%PAGE膠，恒壓120 V，直至溴酚藍前沿至膠前沿約1 cm處停止電泳。用考馬斯亮藍染色，觀察電泳圖譜，并與上述三種蛋白質(zhì)含量測定方法檢測的15批疫苗樣品總蛋白質(zhì)含量進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

2.1.1 改良Lowry法標準曲線 以牛血清白蛋白濃度為縱坐標，以其各濃度在750 nm處吸光值為橫坐標，繪制標準曲線圖1。得回歸方程為 y=379．57x2+300．63x-21．749，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.9993(0.98-1)，顯著相關(guān)。

圖1 改良Lowry法標準曲線圖

2.1.2 考馬斯亮藍法標準曲線 以牛血清白蛋白濃度為縱坐標，以其各濃度在595 nm處吸光值為橫坐標，繪制標準曲線圖2。得回歸方程為 y=1324．1x2-958．85x+216．79，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.994(0.98-1)，顯著相關(guān)。

圖2 考馬斯亮藍法標準曲線圖

2.2 蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果及分析

2.2.1 凱氏定氮法測定結(jié)果 按破乳樣品制備方法對9批疫苗破乳，按1.4.2項方法測定其總蛋白質(zhì)含量，測定結(jié)果見表1。

2.2.2 改良Lowry法測定結(jié)果 按檢測樣品制備方法對15批疫苗樣品進行處理，最后用50 μL去離子水重懸沉淀，按1.4.3項方法測定其在750 nm吸光值，根據(jù)標準曲線得出每一樣品總蛋白質(zhì)含量，每一樣品重復3次，取其平均值，測定結(jié)果見表1。

表1 三種蛋白質(zhì)測定方法三次測定結(jié)果平均值(μg/mL)

2.2.3 考馬斯亮藍法測定結(jié)果 按檢測樣品制備方法對15批疫苗樣品進行處理，最后用50 μL去離子水重懸沉淀，按1.4.4項方法測定其在595 nm吸光值，根據(jù)標準曲線得出每一樣品總蛋白質(zhì)含量，每一樣品平行測定3次，取其平均值，測定結(jié)果見表1。

2.2.4 與經(jīng)典方法比較結(jié)果 凱氏定氮法是一種蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法。因此，將部分樣品改良Lowry法和考馬斯亮藍法測定結(jié)果同凱氏定氮法測定結(jié)果進行了比較，結(jié)果見圖3。

由表1可見，同一批疫苗樣品，不同測定方法測定蛋白質(zhì)含量差異較大，其中凱氏定氮法測定結(jié)果最高，改良Lowry法測定結(jié)果適中，考馬斯亮藍法測定結(jié)果最低。圖3可見不同批次疫苗兩種方法測定結(jié)果所占凱氏定氮法測定結(jié)果百分比各不相同，差異也比較大，其中考馬斯亮藍法測定結(jié)果最低的僅占3.1%。5號和6號總蛋白質(zhì)含量較低，凱氏定氮法未能準確測定其蛋白質(zhì)含量，改良Lowry法和考馬斯亮藍法測定結(jié)果一致。

圖3 改良Lowry法和考馬斯亮藍法測定結(jié)果同凱氏定氮法測定結(jié)果比較

2.2.5 改良Lowry法和考馬斯亮藍法比較試驗結(jié)果 在上述測定基礎(chǔ)上，按檢測樣品制備方法處理選取的6批疫苗樣品，最后分別用50、250、500 μL去離子水重懸，采用這兩種方法測定其蛋白質(zhì)含量，每一樣品每一稀釋度做3次平行測定。測定結(jié)果見表2，ˉx為3次測定結(jié)果平均值，s為標準差，并使用SPSS軟件分析每一方法對疫苗不同稀釋倍數(shù)之間的測定結(jié)果差異性。

表2 兩種方法測定疫苗不同稀釋度蛋白質(zhì)含量結(jié)果(蛋白質(zhì)濃度μg/mL:±s)

表2 兩種方法測定疫苗不同稀釋度蛋白質(zhì)含量結(jié)果(蛋白質(zhì)濃度μg/mL:±s)

測定方法 稀釋 1號 2號 6號 7號 8號 14號原倍 332±44.1 1572±135.7 67±5.88 653±18.36 2009±改良Lowry法171.22 477±64.49 5倍 346±14.1 1587±103.45 252±8.79 716±16.06 1908±8.87 454±16.15 10倍 859±39.03 1776±31.41 164±3.94 744±53.87 1766±105.04 457±38.07考馬斯亮藍法原倍 126±3.41 156±1.30 64±0.32 79±2.45 700±21.05 137±6.28 5倍 328±1.17 341±1.63 321±0.79 329±4.35 473±6.17 329±0.79 10倍 640±2.54 645±2.45 656±3.27 635±0.64 784±23.32 650±10.25

由表2可見，樣品中蛋白質(zhì)含量對改良Lowry法和考馬斯亮藍法測定結(jié)果有一定影響。用SPSS軟件分析6批次疫苗不同稀釋倍數(shù)結(jié)果之間的差異性(結(jié)果未列出)，其中改良Lowry法測定原倍和5倍稀釋測定結(jié)果差異不顯著，個別樣品原倍、5倍和10倍稀釋差異均不顯著，僅6號疫苗差異顯著，分析原因為蛋白質(zhì)含量過低，稀釋后超出改良Lowry法測定范圍;考馬斯亮藍法測定的大部分疫苗樣品不同稀釋倍數(shù)測定結(jié)果差異較顯著。

2.3 SDS-PAGE結(jié)果及分析 按照1.4.6項對15批疫苗進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見表1和圖4。

圖4 疫苗SDS-PAGE電泳圖

SDS-PAGE電泳為定性試驗，其圖譜顏色的深淺與蛋白質(zhì)的量是成正比的。圖4明顯可見部分疫苗SDS-PAGE電泳圖譜差異較大，如5號、10號、7號、2號、8號圖譜顏色依次變深，其改良Lowry法測定蛋白質(zhì)含量分別為 67、443、653、1572、2009 μg/mL，含量依次增加，兩者一致;而考馬斯亮藍法測定5號、10號、7號蛋白質(zhì)含量依次為64、74、79 μg/mL，與圖譜顏色不一致;凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量與圖譜顏色是基本一致的。

3 討論

凱氏定氮法是一種蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法，適用樣品廣泛，其依據(jù)蛋白質(zhì)為含氮的有機化合物，通過測定樣品中氮含量，乘以換算系數(shù)轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的含量，本法靈敏度較低，適用于0.2～2.0 mg氮的測定[3]。本研究采用全自動凱氏定氮法測定，檢測氮含量下限為100 μg(蛋白質(zhì)含量檢測下限為625 μg)，靈敏性更高。但是，我國官方發(fā)布了關(guān)于控制口蹄疫滅活疫苗純度的相關(guān)文件[6]，文件規(guī)定2015年1月1日起，總蛋白含量為每mL疫苗不高于500 μg，顯然超出其檢測范圍。并且此方法操作復雜費時，試劑消耗量大[7]，試驗過程涉及到濃硫酸、雙氧水等危險溶劑的使用。表1中凱氏定氮法測定7批疫苗蛋白質(zhì)含量均明顯高于改良Lowry法和考馬斯亮藍法測定結(jié)果。究其原因，可能是由于生產(chǎn)工藝過程純化不完全，疫苗樣品中氨基酸、核酸等成分中的非蛋白氮也會被換算成蛋白質(zhì)，使得測定結(jié)果要比實際值高。

Lowry法是依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質(zhì)-銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合物，化合物在745～750 nm處有最大吸光值，在此范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，因此可檢測750 nm 光吸收值的大小計算蛋白質(zhì)含量[3-4，5]，本研究采用改良Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，其檢測范圍為1～1500 μg/mL，滿足官方規(guī)定蛋白質(zhì)含量要求，幾乎所有疫苗樣品中蛋白質(zhì)含量均在此范圍內(nèi)。此外，本方法直接檢測蛋白質(zhì)含量，排除了凱氏定氮法中非蛋白氮影響，測定蛋白質(zhì)含量相對準確，對同一批樣品多次重復實驗，結(jié)果平行性較好。

考馬斯亮藍法是依據(jù)在酸性溶液中考馬斯亮藍G250與蛋白質(zhì)分子中的堿性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸結(jié)合形成藍色復合物，復合物在465～595 nm處有最大吸光值，在此范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，因此可檢測595 nm光吸收值的大小計算蛋白質(zhì)含量[3-4，8]。本研究使用的試劑盒檢測范圍為100～1500 μg/mL，部分樣品超出其檢測范圍，需要做濃縮或稀釋處理。

與凱氏定氮法相比，改良Lowry法和考馬斯亮藍法則操作過程簡單、迅速、試劑消耗量小，可以通過準確配取標準蛋白溶液，直接測定樣品中蛋白質(zhì)含量，排除凱氏定氮法中非蛋白氮對測定結(jié)果影響。表1結(jié)果顯示考馬斯亮藍法測定值明顯低于改良Lowry法測定值。與本實驗結(jié)果相似，1976年，Bradford M M[9]指出BSA溶液酶解后考馬斯亮藍法測定其蛋白質(zhì)含量結(jié)果要比酶解前低。馬志鵬等[10]比較了改良Lowry法和考馬斯亮藍法測定標準牛血清白蛋白(BSA)水溶液在堿性蛋白酶水解前與后的蛋白質(zhì)含量，其結(jié)果表明未進行酶解的BSA水溶液，兩種方法測定的蛋白質(zhì)含量相當;BSA水溶液酶解后，使用改良Lowry法測定的蛋白質(zhì)含量與酶解前的值相近;使用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量值較酶解前出現(xiàn)大幅下降。馬志鵬等[10]比較了改良Lowry法和考馬斯亮藍法對O型口蹄疫病毒滅活抗原總蛋白含量測定，結(jié)果表明改良Lowry法能夠更加精確、真實地反映O型口蹄疫病毒滅活抗原總蛋白含量。因此，改良Lowry法能較真實的反映口蹄疫滅活疫苗中蛋白質(zhì)含量，與凱氏定氮法相比，此方法操作簡單，工作效率高，而且低耗。

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