張麗麗，劉寶山，褚 芹△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193)

中風(fēng)病按病理變化可分為出血性中風(fēng)和缺血性中風(fēng)，其中缺血性中風(fēng)占60～80%以上。缺血性中風(fēng)的防治一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。臨床研究顯示，醒腦開竅針法對中風(fēng)有確切的療效[1－4]，經(jīng)30余年的臨床實(shí)踐和多學(xué)科的基礎(chǔ)研究，已成為一套科學(xué)的、規(guī)范的中風(fēng)病診療體系。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白－1(Neuregulin－1，NRG－1)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠抑制腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，在缺血性卒中過程中具有神經(jīng)保護(hù)作用。NRG－1的功能性受體是由ErbB受體酪氨酸激酶所組成，其中ErbB4既能與NRG－1結(jié)合，又具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性。國內(nèi)外研究[5－7]顯示外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子NRG－1可減輕缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，作為抵抗缺血性卒中的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，為腦缺血損傷的臨床治療提供了一個新思路。但外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子難以通過血腦屏障，如何誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)成為亟待解決的問題。本研究以NRG及其受體為切入點(diǎn)，通過醒腦開竅針法電針刺激水溝和內(nèi)關(guān)，應(yīng)用HE、TUNEL和免疫組化技術(shù)，觀察醒腦開竅針法對缺血/再灌注大鼠腦組織病理形態(tài)、神經(jīng)元凋亡、NRG－1及其受體ErbB4蛋白表達(dá)的影響，探索醒腦開竅針法在缺血性中風(fēng)中的神經(jīng)保護(hù)作用是否與誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子NRG－1及其受體ErbB4的表達(dá)有關(guān)，為醒腦開竅法治療缺血性中風(fēng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備及分組

健康雄性SD大鼠，體重200～250 g。采用 Zea Longa[8]改良的線栓法制備動物腦缺血再灌注模型，缺血1 h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注，再灌注時間為24 h。

神經(jīng)功能評定采用Zea Longa[8]神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)。0分:沒有神經(jīng)功能缺陷;1分:提起尾巴右側(cè)前腿不能伸直;2分:行走時向右側(cè)偏斜;3分:行走時向右側(cè)傾倒;4分:意識不清或無自主性運(yùn)動。對MCAO大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評估，1≤評分≤3分者納入實(shí)驗(yàn)。

將造模成功的18只SD大鼠按體重分為3個組，再將每組大鼠隨機(jī)分為模型組、穴位組(醒腦開竅組)和非穴位組，每組6只;另設(shè)正常組和假手術(shù)組，每組各6只。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑

SP－9000免疫組化染色試劑盒(北京中杉公司)、DAB酶底物顯色試劑盒(北京中杉公司)、BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)、Western Blotting Luminol Reagent(Santa Cruz公司)、Tunel檢測試劑盒(Roche公司)、瓊脂糖(西班牙Agarose公司)、顯微鏡(日本奧林巴斯，BX51T－PHD－J11)、CMOS(日本奧林巴斯)、多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司Image－Pro Plus)和HANS LHZOZS電針儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物干預(yù)

穴位組和非穴位組大鼠使用HANS LH202S電針儀，疏密波，電壓2 V，頻率2/15 Hz，電流1 mA。穴位組電針儀的兩極接水溝、內(nèi)關(guān)(同側(cè))，水溝定位為大鼠唇裂鼻尖下1 mm正中處，用30號0.5寸華佗牌毫針向鼻中隔方向斜刺0.2～0.3 cm;內(nèi)關(guān)為大鼠前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間，用30號0.5寸華佗牌毫針直刺0.2～0.3 cm。非穴位組的電極一端接同側(cè)腋橫紋下3 mm的非穴位處，另一端接尾骨尖下3 mm的非穴位處。在穴位組和非穴位組，大鼠再灌注后1 h、12 h及24 h各施用電針1次。其余各組不予任何處理。

1.4 切片制備

大鼠于再灌注24 h時常規(guī)灌注取材。將大鼠深度麻醉，經(jīng)心臟灌注，迅速斷頭取腦，以視交叉為中心取5 mm的冠狀切片，置于4%多聚甲醛中固定24 h。梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。用切片機(jī)行連續(xù)冠狀切片，厚5 um，隔五取一，行HE、TUNEL和免疫組化染色。

1.5 HE 染色步驟

將石蠟切片放于60℃烤箱中烘烤30 min，取出后至室溫;二甲苯透明脫蠟各10 min;酒精梯度脫水各10 min;蘇木素染色15 min，清水沖洗10 min;酒精分色3 min，清水沖洗10 min;伊紅染料復(fù)染3～5 min;梯度酒精脫水各10 min;二甲苯透明，中性樹膠封片;光鏡下觀察腦組織染色情況。

1.6 TUNEL 法

心臟灌注后，取腦，從視交叉開始，取3 mm厚冠狀切片，制作石蠟切片(5 um)，行TUNEL染色。染色步驟按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作。細(xì)胞核呈棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，結(jié)合形態(tài)特征，可確立凋亡細(xì)胞。

1.7 免疫組化具體步驟

將石蠟包塊切成厚度為5 μm連續(xù)組織切片，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃烘烤1 h。將切片先后用二甲苯脫蠟、乙醇常規(guī)至水化。切片放入盛有檸檬酸鹽的緩沖液中，再放入微波爐內(nèi)用中高檔進(jìn)行抗原修復(fù)8 min，自然冷卻至室溫。1%甲醇雙氧水，室溫10 min，消除內(nèi)源性過氧化酶活性，PBS洗3次，每次5 min。滴加10%山羊血清封閉液，室溫20 min，勿洗。滴加一抗，4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加生物素化二抗(IgG)，37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S－A/HRP)，37℃20 min，PBS洗 3次，每次5 min。DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒1 ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，滴加至切片上，光學(xué)顯微鏡下觀察，以棕黃色為陽性表達(dá)，顯色約10 min，自來水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染1 min，自來水返藍(lán)。經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。顯微鏡觀察，進(jìn)行400×的顯微照相。

1.8 圖像分析

每只大鼠切片中選取呈典型反應(yīng)的3張切片，每張切片在高倍鏡下(400×)對皮層陽性細(xì)胞高表達(dá)區(qū)域，隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。采用IPP軟件分析系統(tǒng)(Image－Pro Plus 6.0)對染色結(jié)果進(jìn)行分析處理。測量累積光密度(integrated optical density，IOD)和面積(area)，計(jì)算平均光密度(average optical density，AOD)IOD/area。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HE 染色

HE染色可見缺血再灌注模型皮層缺血梗死區(qū)廣泛的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，胞體變形，深染，見封三彩圖1中D。然而，在缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞腫脹，體積增大，形態(tài)變圓，細(xì)胞間隙變小，見封3彩圖1中C。缺血側(cè)大腦皮層可見梗死區(qū)(封三彩圖1中*處)大量神經(jīng)細(xì)胞變形深染，而周圍區(qū)域(封三圖1中△處)神經(jīng)細(xì)胞體積增大，只有極少量變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞。

2.2 TUNEL 結(jié)果

正常組和假手術(shù)組的大鼠在大腦皮層幾乎未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞。模型組、非穴位組和穴位組出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的百分率分別為(36.78±5.43)%、(31.83 ±5.74)%和(27.2 ±8.31)%，但穴位組與模型組、穴位組與非穴位組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 免疫組化結(jié)果

正常組和假手術(shù)組大鼠大腦皮層僅有少量NRG－1及ErbB4的陽性細(xì)胞表達(dá)。缺血1 h再灌注24 h，模型組、非穴位組大鼠大腦皮層缺血半暗帶NRG－1陽性細(xì)胞表達(dá)增加，而穴位組NRG－1陽性細(xì)胞表達(dá)進(jìn)一步增加，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(穴位組與正常組比較P=0.000，穴位組與假手術(shù)組比較P=0.000，穴位組與模型組比較 P=0.018，穴位組與非穴位組比較P=0.022)。穴位組ErbB4陽性細(xì)胞表達(dá)，與正常組和假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(穴位組與正常組比較P=0.028，穴位組與假手術(shù)組比較P=0.010);而與模型組或非穴位組之間差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見封三彩圖2和表2。

表2 NRG－1及ErbB4免疫組化染色結(jié)果的IPP圖像分析(±s)

表2 NRG－1及ErbB4免疫組化染色結(jié)果的IPP圖像分析(±s)

注:與正常組比較，▲P ＜0.05;與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，*P ＜0.05;與非穴位組比較，★P ＜0.05。

6 0.0636 ±0.0170 0.0672 ±0.0138假手術(shù)組 6 0.0741 ±0.0064 0.0598 ±0.0045模型組 6 0.0930±0.0081▲△ 0.0772±0.0087△非穴位組 6 0.0936±0.0132▲△ 0.0797±0.0198穴位組 6 0.1079 ±0.0098▲△＊★ 0.1056 ±0.0195平均光密度正常組組別 樣本數(shù) NRG－1平均光密度 ErbB4▲△

3 討論

在本研究中，模型組大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶NRG－1陽性細(xì)胞表達(dá)高于正常對照組和假手術(shù)組，提示內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子增多，其原因可能是梗死本身作為一種刺激因素促進(jìn)了內(nèi)源性NRG－1的表達(dá)，這在Parker等[9]和 Pankonin 等[10]的研究中已經(jīng)證實(shí)。穴位組NRG－1的表達(dá)高于模型組和非穴位組，提示電針刺激水溝和內(nèi)關(guān)使皮層缺血半暗帶內(nèi)源性NRG－1的表達(dá)增加更顯著。Xu和Ford[11]利用大鼠大腦中動脈閉塞模型對缺血性卒中后ErbB受體的分布進(jìn)行了研究，與NRG－1相似，在MCAO后24 h同側(cè)皮質(zhì)梗死周圍可觀察到ErbB4的大量表達(dá)。電針刺激水溝和內(nèi)關(guān)能提高缺血再灌注大鼠內(nèi)源性NRG－1的表達(dá)，彌補(bǔ)了外源性NRG－1半衰期短、不能進(jìn)入血腦屏障的缺陷。本研究結(jié)果表明醒腦開竅針刺法在缺血性中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)作用與提升內(nèi)源性NRG－1及其受體ErbB4有關(guān)，為醒腦開竅法治療缺血性中風(fēng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

凋亡在腦缺血的發(fā)展中起著重要作用。在腦缺血性損傷發(fā)生發(fā)展過程中，凋亡神經(jīng)元的多少直接決定著壞死的神經(jīng)元數(shù)量和梗死區(qū)域的面積，與缺血損傷后繼發(fā)性損害的程度密切相關(guān)，所以及時遏制凋亡的啟動環(huán)節(jié)是挽救凋亡前期神經(jīng)元的關(guān)鍵。醒腦開竅針法與非穴位和模型組比較，在降低凋亡細(xì)胞百分率上雖未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是在一定程度上抑制了神經(jīng)元的凋亡。神經(jīng)保護(hù)作用可能通過如下作用:針刺水溝可直接興奮上行激活系統(tǒng)，解除腦細(xì)胞的抑制狀態(tài)，可特異性地增加頸動脈血流，糾正血流動力學(xué)紊亂，改善腦循環(huán);針刺內(nèi)關(guān)可改善中風(fēng)患者的心排血量，改善腦血氧供應(yīng)。從而改善缺血半暗帶血氧供應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡。

目前，針刺誘導(dǎo)內(nèi)源性NRG－1和ErbB4表達(dá)的研究國內(nèi)外未見報道。本研究采用在體實(shí)驗(yàn)，對醒腦開竅針刺法治療缺血性中風(fēng)的機(jī)理從誘導(dǎo)內(nèi)源性的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白NRG－1角度進(jìn)行研究。研究結(jié)果證明醒腦開竅針刺法在缺血性中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)作用與提升內(nèi)源性NRG－1及其受體ErbB4有關(guān)。

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