張 勤，應灣灣，葛丹婷，房躍群，李 濤

(浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004)

轉錄因子Nkx2.5 是關鍵的心肌發(fā)育調控因子.Nkx2.5 具有調控心肌基因表達、誘導發(fā)育分化、抗凋亡等重要作用.Nkx2.5 在心肌開始分化前即開始表達，是所有脊椎動物心臟發(fā)育中最早表達的轉錄因子之一［1］，并參與房室結構、流出道和傳導系統(tǒng)的形成.Nkx2.5 突變小鼠死于胚胎發(fā)育9～10 d，檢測發(fā)現(xiàn)其心室壁結構薄弱、房室間隔缺損、心臟環(huán)化障礙［2］.在非洲爪蟾的胚胎中發(fā)現(xiàn)，過表達Nkx2.5 會擴增心肌細胞數(shù)目而導致心臟肥大［3］.把Nkx2.5 注射到斑馬魚胚胎中也會促使其心臟肥大性發(fā)育，甚至導致心肌基因的異位表達［4］.此外，研究發(fā)現(xiàn)Nkx2.5 及其相關的GATA4 轉錄因子均具有保護心肌細胞、拮抗氧化損傷的作用［5-6］.心肌特異性過表達Nkx2.5 的轉基因小鼠的心臟對阿霉素引發(fā)的凋亡相對不敏感.

目前，干細胞研究中的一大熱點是:誘導骨髓間充質及其他成體干細胞成為心肌細胞，并修復心肌梗死的缺陷區(qū)域及功能［7］.Nkx2.5 及GATA4 具有誘導心肌分化及抗凋亡的雙重作用，是基因修飾干細胞治療的理想候選分子.本研究通過構建Nkx2.5 過表達的重組腺病毒，以期為進一步研究Nkx2.5 的功能及潛在的醫(yī)學應用價值奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

含Nkx2.5 cDNA 全長序列的pFLAG-Nkx2.5質粒由Harvey R P 教授(Victor Chang Cardiac Research Institute，Sydney，Australia)惠贈.腺病毒穿梭質粒pAdTrackcmv，骨架質粒pAdEasy-1，JM109菌、BJ5183 菌、Hela 細胞和H9c2 細胞均為本實驗室保存.限制性內切酶Pme Ⅰ(NEB)，Pac Ⅰ(NEB)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，質粒提取試劑盒(威格拉斯).蛋白酶K 購自Merck 公司;MMLV 反轉錄酶購自Promega 公司;Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶均購自New England Biolabs公司;DNA marker 購自北京TIANGEN 公司;H2O2，噻唑藍(MTT)及Hoechst33342 購自Sigma公司.抗Nkx2.5 抗體購自Santa Cruz 公司.DNA序列合成由北京奧科公司完成.

1.2 Ad-Nkx2.5 腺病毒質粒的構建及包裝

腺病毒包裝方法見文獻［8］.將pFLAGNkx2.5 和腺病毒穿梭質粒pAdtrackcmv 用BglⅡ和SalⅠ進行大量雙酶切.酶切DNA 片段回收，建立Nkx2.5 和pAdtrackcmv 定向連接反應體系，構建pAdtractcmv-Nkx2.5 質粒.經(jīng)PmeⅠ線性化的pAdtrackcmv-Nkx2.5 質粒熱休克轉化事先轉入腺病毒骨架質粒pAdEasy-1 的BJ5183 感受態(tài)菌，培養(yǎng)過夜后挑選克隆較小的菌落，小提質粒后，PacⅠ酶切鑒定正確的pAd-Nkx2.5 重組腺病毒質粒.pAd-Nkx2.5 質粒轉化JM109 菌大提質粒用于細胞轉染.pAd-Nkx2.5 質粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，用Lipofectamine 2000 脂質體轉染293A 細胞，于轉染后持續(xù)觀察細胞形態(tài)和病毒噬斑的變化.于轉后14 d 左右，待所有細胞感染病毒、變圓漂浮后，收集細胞，磷酸鹽緩沖液漂洗后液氮反復凍融細胞3 次，1 000 r/min 離心10 min 后收集上清液凍存.倍比稀釋后感染293A 細胞，24 h 后熒光顯微鏡觀察，按公式

計算病毒滴度.對照空病毒為既往保存.

1.3 重組Ad-Nkx2.5 腺病毒的PCR 鑒定

取5 μL 病毒液，加入10 μL 聚合酶鏈式反應(PCR)級蛋白酶K，于55 ℃作用1 h 后沸水浴5 min，取1 μL 做模板，PCR 擴增Nkx2.5 以鑒定目的基因重組于病毒中.PCR 引物:正向引物為5′-GACAAAGCCGAGACGGAT-3′，反向引物為5′-GAAGCTCCAGAGTCTGGT-3′.產(chǎn)物長度為240 bp，退火溫度為62 ℃，PCR 循環(huán)數(shù)為30.

1.4 Nkx2.5 蛋白表達的Western blot 檢測

Hela 細胞接種于6 孔板上，培養(yǎng)過夜后分別加入感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100 的病毒液.提取蛋白，二辛可酸(BCA)法蛋白定量.30 μg 蛋白煮沸后，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入抗Nkx2.5 一抗雜交，辣根過氧化物酶標記二抗孵育后化學發(fā)光法顯色.

1.5 乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)及病毒感染

出生1～3 d 的大鼠，無菌操作下取出心臟，剪除心房，將心室放于含1 g/L 胰蛋白酶和0.5 g/L 膠原酶Ⅰ的消化液中，剪碎后置于4 ℃連續(xù)消化，收集懸液，離心，取細胞沉淀，加入含5%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基鋪板，以差速貼壁法去除成纖維細胞，調整細胞密度，接種于12 孔板中，在37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，至24 h后感染腺病毒，48 h 后熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光表達效率和細胞形態(tài).

1.6 逆轉錄PCR 檢測

參照文獻［8］提取RNA 進行逆轉錄PCR(RT-PCR).PCR 引物及擴增條件:GAPDH 基因，正向引物為5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′，反向引物為5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3，擴增條件為58 ℃退火，共25 個循環(huán)，產(chǎn)物大小為413 bp;ANF 基因，正向引物為5′-GGCTCCTTCTCCTCACCAA-3′，反向引物為5′-CTCTGAGACGGGTTGACTTCC-3′，擴增條件為60 ℃退火，共30 個循環(huán)，產(chǎn)物大小為269 bp;β-MHC 基因，正向引物為5′-GAGTGGACGTTTATTGACTTCGG-3′，反向引 物 為5′-GCCTTTCTTTGCTTTGCCTTT-3′，擴增條件為61 ℃退火，共27 個循環(huán)，產(chǎn)物大小為405 bp.

1.7 H9c2 細胞存活率的噻唑藍法檢測

參照文獻［9］.活細胞代謝將噻唑藍(MTT)轉化為結晶紫，反映活細胞的相對數(shù)目.將感染病毒的H9c2 細胞以1 ×105/孔接種至96 孔板，以含100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL 氨芐青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的改良DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng).改良DMEM 培養(yǎng)基偏酸性，每升含15.6 g 培養(yǎng)基粉末、1.5 g NaHCO3.24 h 后加入H2O2至終濃度為200 μmol/L 誘導細胞，于作用后指定時間點加入10% 5 mg/mL MTT 溶液，37 ℃孵育4 h 后終止培養(yǎng).每孔加入150 μL 二甲基亞砜，混勻10 min 使結晶紫充分溶解.在酶標儀490 nm 波長下測量吸光度，按公式

圖1 pAd-Nkx2.5 質粒的構建及鑒定

計算細胞存活率.每組設4 個復孔，實驗重復3 次.H2O2處理組與對照組相比，用配對t 檢驗法進行統(tǒng)計檢驗.

1.8 Hoechst33342 染色及熒光觀察

H9c2 細胞加入終質量濃度為1 μg/mL 的Hoechst33342 避光染色30 min，磷酸鹽緩沖液漂洗后繼續(xù)培養(yǎng).200 μmol/L H2O2處理6 h 后于倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯)下觀察細胞形態(tài)及核形態(tài)變化，隨機采取10 個視野拍照.

1.9 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行t 檢驗和單因素方差分析.P ＜0.05表示有顯著性差異，P ＜0.01 表示有非常顯著性差異.

2 結果

2.1 pAd-Nkx2.5 質粒的構建

pFLAG-Nkx2.5 質粒經(jīng)BglⅡ和SalⅠ雙酶切后釋放約1.1 kb 的Nkx2.5 基因片段.將該片段連接入pAdtrackcmv 骨架質粒中，重組成功后再經(jīng)雙酶切鑒定，結果如圖1(a)所示.將經(jīng)PmeⅠ線性化的pAdtrackcmv-Nkx2.5 轉入含pAdEasy-1腺病毒骨架質粒的BJ5183 菌，進行同源重組，經(jīng)卡那霉素篩選，提取克隆形態(tài)較小的菌落進一步PacⅠ酶切鑒定.正確重組的腺病毒質粒約33 kb，可因重組位點不同由PacⅠ酶切切出一個3.0 或4.5 kb 的小片段，結果如圖1(b)所示.可以發(fā)現(xiàn):經(jīng)篩選的重組體clone 1 無法切出大片段，經(jīng)鑒定為未重組的pAdtrackcmv-Nkx2.5質粒;而clone 2可以切出一大片段及一個4.5 kb 的小片段，鑒定為pAd-Nkx2.5質粒.

2.2 Ad-Nkx2.5 腺病毒的包裝及鑒定

構建成功的pAd-Nkx2.5 質粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，轉染293A 細胞進行包裝.Ad-Easy 系統(tǒng)自帶EGFP 基因，可通過熒光顯微鏡觀察表達EGFP 的病毒噬斑快速判斷病毒包裝進度.轉染后逐日觀察，2 d 起出現(xiàn)噬斑，7 d 后逐步增多，14 d左右可見大量表達綠色熒光蛋白的病毒噬斑(見圖2(a))，同時細胞形態(tài)變圓、貼壁不牢.收獲裂解細胞，取上清液繼續(xù)感染細胞以擴增病毒，最后收獲大量的病毒懸液，經(jīng)倍比稀釋法測得重組Ad-Nkx2.5 病毒滴度為5 ×1011efu/mL.由于重組Ad-Easy 腺病毒可能存在回復突變而導致插入基因片段丟失，為了進一步確認Ad-Nkx2.5 病毒是否含有正確的插入片段，因而提取病毒上清液進行PCR 鑒定，結果如圖2(b)所示.pFLAGNkx2.5 質粒及Ad-Nkx2.5 病毒上清液均能擴增出Nkx2.5 目的片段，而對照組Ad-EGFP 病毒未攜帶Nkx2.5 基因片段，故無擴增片段.按感染復數(shù)(MOI)為100 感染HeLa 細胞(Hela 細胞為子宮頸癌細胞，無Nkx2.5 表達)，裂解細胞通過Western blot 檢測到約37 kD 的Nkx2.5 蛋白表達，而Ad-EGFP 病毒組未檢測到Nkx2.5 表達(見圖2(c)).上述實驗表明，過表達Nkx2.5 基因的Ad-Nkx2.5 重組腺病毒已成功包裝.

圖2 重組Nkx2.5 腺病毒的包裝及鑒定

2.3 Ad-Nkx2.5 腺病毒的乳鼠心肌細胞感染

胰酶/膠原酶消化法分離乳鼠心肌細胞，細胞形態(tài)呈短桿分支狀.原代乳鼠心肌細胞生長24 h后，按MOI 為100 的病毒量感染乳鼠心肌細胞.倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，80%以上的細胞表達綠色熒光蛋白，細胞形態(tài)清晰.Ad-Nkx2.5 感染組細胞貼壁更為牢固，形態(tài)鋪展，表面積增加，似肥大狀表型(見圖3(a)).提取RNA 進行RT-PCR檢測Nkx2.5 下游基因ANF 及β-MHC 的表達，以GAPDH 作為內參，結果顯示:Ad-Nkx2.5 感染后乳鼠心肌細胞的ANF 及β-MHC 表達明顯增強(見圖3(b)).這些結果表明Ad-Nkx2.5 腺病毒能夠表達功能性Nkx2.5 蛋白，調控乳鼠心肌細胞對Nkx2.5 下游基因的表達.從而證明了功能性的Ad-Nkx2.5 腺病毒構建成功.

2.4 Ad-Nkx2.5 腺病毒感染對H2O2介導H9c2細胞凋亡的拮抗

Nkx2.5是維持心肌內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要轉錄因子.H9c2 大鼠心肌細胞系在H2O2等外源刺激下可呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)和生化改變.H9c2 細胞感染Ad-Nkx2.5 及Ad-EGFP 腺 病 毒(MOI 為100)，200 μmol/L H2O2處理細胞后，通過MTT 法檢測細胞活力，結果如圖4 所示.Ad-Nkx2.5 病毒感染后，顯著提高了H9c2 細胞的存活率.其中:

圖3 Ad-Nkx2.5 重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞

圖4 Ad-Nkx2.5 腺病毒感染后對H9c2 細胞抗氧化損傷能力的影響

H2O2誘導4 h 后，Ad-Nkx2.5 組細胞存活率為(87.5 ±1.9)%，Ad-EGFP 組為(43.3 ±2.5)%(P ＜0.01，n=4);H2O2誘導8 h 后，Ad-Nkx2.5組細胞存活率為(82.5 ±2.3)%，Ad-EGFP 組為(27.8 ±3.7)%(P ＜0.01，n=4);H2O2誘導12 h后，Ad-Nkx2.5 組細胞存活率為(75.4 ±1.8)%，Ad-EGFP 組為(22.1 ±1.9)%(P ＜0.01，n=4).

Ad-Easy 腺病毒感染細胞后表達綠色熒光蛋白，顯示細胞形態(tài)結構;同時，采用親核染料Hoechest33342 對細胞核進行熒光染色，即可對H9c2細胞凋亡的形態(tài)改變進行觀測，結果如圖5 所示.H9c2 細胞感染Ad-EGFP 病毒，200 μmol/L H2O2處理6 h 后，即出現(xiàn)典型的凋亡表現(xiàn):細胞皺縮，細胞間連接消失，部分細胞發(fā)生脫落飄浮，胞膜有小泡狀形成，細胞核固縮，密度增加，部分核碎裂，部分細胞綠色熒光消失，細胞崩解.而Ad-Nkx2.5感染組發(fā)生細胞皺縮和核固縮的細胞數(shù)目明顯少于Ad-EGFP 組，說明重組腺病毒介導的Nkx2.5過表達可抑制H2O2誘導的H9c2 細胞凋亡.

圖5 Ad-Nkx2.5 腺病毒感染抑制H9c2細胞凋亡的形態(tài)學變化(×200)

3 討論

心肌細胞作為終末分化細胞，一旦壞死或凋亡基本無再生能力，只能進行瘢痕修復，造成心肌收縮和傳導功能不可逆性的損失.近年來，應用骨髓間充質干細胞及其他成體干細胞修復病損心肌組織成為研究的熱點.盡管成體干細胞存在取材方便、無移植排斥、無倫理問題等優(yōu)勢，但其橫向分化為心肌樣細胞受誘導分化微環(huán)境的調控，分化效率有限.如何提高誘導分化效率從而更好地改善心功能，仍然是一個有待深入研究的科學問題.目前，人們通過藥物誘導、微環(huán)境模擬、電場刺激、轉基因等方式，對成體干細胞進行心肌誘導分化的嘗試［7］.通過轉基因定向誘導干細胞向心肌分化，Nkx2.5 是一個重要的候選基因.

Nkx2.5 是果蠅tinman 的同源基因，均為控制體節(jié)發(fā)育的同源異型盒基因家族成員.果蠅的tinman 基因是第一個被證實在果蠅心臟形成和分化中起關鍵作用的轉錄因子，tinman 基因突變可以使果蠅心臟缺失或異常.Nkx2.5 則是調控哺乳動物心臟發(fā)育和功能執(zhí)行的關鍵轉錄因子.原位標記技術顯示，在小鼠胚胎發(fā)育7.5 d 時Nkx2.5即開始在生心板表達［1］.

Nkx2.5 通過調控心肌基因表達從而廣泛地參與了心臟發(fā)育及其功能維持，如心肌分化、房室結構組建、流出道形成、傳導系統(tǒng)發(fā)育和功能維持.目前已知Nkx2.5 的下游基因涉及到心肌泵功能相關蛋白、分泌性蛋白、縫隙鏈接和電傳導相關蛋白、細胞外基質相關蛋白、鈣調控相關蛋白和心肌轉錄因子［10-12］等.因此，Nkx2.5 純合子突變會導致胚胎發(fā)育中斷而死亡;其雜合子突變會導致各種先天性心臟病，最常見的是房間隔缺損和房室傳導阻滯［10］.Jay 等［13］發(fā)現(xiàn)，在Nkx2.5 缺失時，心臟傳導系統(tǒng)的細胞減少、傳導和電生理異常，其機理可能與Nkx2.5 調控傳導細胞縫隙連接Connexin40 相關.Pashmforoush 等［14］在小鼠出生后于心室組織特異性地敲除Nkx2.5 表達，發(fā)現(xiàn)心小梁形成、腔室擴大進而表現(xiàn)為漸進性心衰;同時，特定肌細胞來源的房室結細胞逐漸被疤痕組織所取代，導致心臟電傳導缺失.從而證實出生后心臟泵系統(tǒng)和傳導系統(tǒng)的功能維持同樣依賴于Nkx2.5 的正常表達.此外，Nkx2.5 是首個被溯源發(fā)現(xiàn)的法樂氏四聯(lián)癥致病基因，目前已經(jīng)建立了Nkx2.5 基因突變與多個人類先天性心臟病的病理關聯(lián)［15］.Nkx2.5 突變的患者常表現(xiàn)為各種心臟發(fā)育異常和傳導阻滯.

基于Nkx2.5 的功能多樣性和重要性，目前已在多種細胞中驗證了其誘導干細胞心肌特異分化的能力.例如:在P19 畸胎瘤干細胞中發(fā)現(xiàn)，過表達Nkx2.5 可以讓細胞擺脫對外源誘導劑的依賴，僅需形成擬胚體即可分化為跳動的心肌細胞［16］;Nkx2.5 過表達的胚胎干細胞向心室肌優(yōu)勢分化，同時削弱了向血管系統(tǒng)分化的能力［17］.研究亦表明，Nkx2.5 單一過表達或GATA4 協(xié)同過表達的骨髓干細胞均能增強心肌誘導分化能力，從而改善心肌梗死區(qū)域的功能［18-19］.此外，篩選Nkx2.5 表達陽性的心肌前體細胞或心肌干細胞加以擴增和誘導分化，也在研究之中［20-21］.另外，Nkx2.5 能夠保護心肌細胞，拮抗外源刺激造成的損傷和凋亡，但具體機制尚不明了［5-6］.因此，Nkx2.5 陽性細胞不但可以增強心肌特異分化能力，還有助于細胞在缺血、缺氧、炎癥細胞侵潤、壓力超負荷、氧化應激、感染等凋亡誘導條件下的存活.

本研究成功包裝重組了Nkx2.5 過表達腺病毒，感染原代乳鼠心肌細胞及傳代H9c2 細胞，并驗證了其調控心肌基因表達及拮抗氧化損傷的能力，為進一步研究Nkx2.5 的功能及潛在的臨床應用價值奠定了基礎.重組Nkx2.5 病毒可應用于多個研究領域，如干細胞心肌誘導分化、心梗后的心肌凋亡與修復、心肌內穩(wěn)態(tài)維護、心肌傳導阻滯的轉基因治療等.

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