張 圓 江佳富詹 琳孫 毅曹務(wù)春**

(1.中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，長(zhǎng)沙 410078；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

泰勒蟲病是由泰勒科(Theileriidae)泰勒屬Theileria原蟲引起經(jīng)蜱傳播的一種疾病,可以侵襲馬、牛、羊、鹿、駱駝、和其他野生動(dòng)物的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)細(xì)胞和紅細(xì)胞(Schnittgeretal., 2003)。目前羊致病種類國(guó)外報(bào)道主要有萊氏泰勒蟲T.lestoquardi、綿羊泰勒蟲T.ovis、隱藏泰勒蟲T.recondita和分離泰勒蟲T.separata等(Alanietal., 1988; Yinetal., 2007)，在我國(guó)主要是呂氏泰勒蟲T.luwenshuni、尤氏泰勒蟲T.uilenbergi和綿羊泰勒蟲T.ovis等。我國(guó)羊泰勒蟲病最早于1958年在四川發(fā)現(xiàn)，隨后在青海、甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、河北、寧夏、新疆等地均有本病的報(bào)道(郭淑珍等，2003;高玉龍等，2005)。我國(guó)東北吉林地區(qū)也是重要的畜牧區(qū)，該地區(qū)也已有羊泰勒蟲病的報(bào)道(田萬年等，2008a)，并通過相對(duì)保守區(qū)的短基因片段(459 bp)的檢測(cè)認(rèn)為是青海羊中分離株Theileriaspp. China 1型，沒有準(zhǔn)確定種。另外，由于該地區(qū)地形地貌較為多樣，媒介蜱種類多，是否還有其他型別的泰勒蟲感染也是一個(gè)關(guān)注的問題。為此，基于泰勒蟲對(duì)該地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的嚴(yán)重威脅,為采取更加有針對(duì)性地有效措施，我們?cè)诩脂q春地區(qū)采集山羊血液，利用泰勒蟲18S rRNA 基因序列，采用PCR方法了解吉林省山羊中泰勒蟲的感染情況，初步確定該地區(qū)羊泰勒蟲的優(yōu)勢(shì)蟲株，為該地區(qū)羊泰勒蟲病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2009年5月份，在吉林省琿春市與俄羅斯、朝鮮毗鄰的敬信地區(qū)山羊泰勒蟲流行地點(diǎn)采集山羊血液，每份5 mL至EDTA抗凝管中，-20 ℃保存，送至軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所待測(cè)。

1.2 DNA提取

每份血液樣本取200 μL，使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(天根公司)，按照說明書操作提取DNA，-20 ℃保存，備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中注冊(cè)的Theileriaspp.18S rRNA全長(zhǎng)基因序列，采用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，進(jìn)行全長(zhǎng)分段擴(kuò)增。上半段引物為Bvi-fshang和Bvip-r，下半段引物為Bvip-f和Bvi-r2(表1)，分別擴(kuò)增泰勒蟲約700、900 bp片段，拼接后得到全長(zhǎng)。

表1 本研究檢測(cè)泰勒蟲所用引物Tab.1 Primers used to detect Theileria spp. in this study

1.4 PCR

采用TaKaRa公司Premix TaqTM試劑和dNTP Mixture試劑，并按說明書操作，上半段擴(kuò)增體系總體積為20 μL，包括DNA 2 μL、10×PCR緩沖液2 μL、濃度為2.5 mmol/L的dNTP Mixture 0.8 μL、Taq DNA聚合酶1 U、濃度為10 μmol/L的引物Bvi-fshang和Bvip-r各0.4 μL，水14.2 μL。反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸50 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。下半段擴(kuò)增引物用Bvip-f和Bvi-r2，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與上半段相同。本次實(shí)驗(yàn)用水做陰性對(duì)照。取PCR產(chǎn)物5 μL，于1.2%含EB的瓊脂糖凝膠中電泳觀察結(jié)果。

1.5 測(cè)序與序列分析

將PCR擴(kuò)增陽性核酸片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根公司)進(jìn)行切膠純化后，送天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，雙向測(cè)通并應(yīng)用NCBI提供的BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，用MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列合并及做系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

共采集到70只山羊的血液，通過PCR檢測(cè)，其中有51份用引物Bvi-fshang和Bvip-r及引物Bvip-f 和Bvi-r2均擴(kuò)增出清晰的目的條帶，長(zhǎng)度近700、900 bp，大小符合預(yù)測(cè)值(圖1)，感染率為72.9%。

圖1 山羊血液標(biāo)本中泰勒蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Amplification 18S rRNA of Theileria spp. in goat1: 山羊2號(hào)Bvi-fshang和Bvip-r擴(kuò)增產(chǎn)物；2: 山羊6號(hào)Bvi-fshang和Bvip-r擴(kuò)增產(chǎn)物；3: 空白對(duì)照Bvi-fshang和Bvip-r；4: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；5. 山羊2號(hào)Bvi-f和Bvip-r2擴(kuò)增產(chǎn)物；6. 山羊6號(hào)Bvi-f和Bvip-r2擴(kuò)增產(chǎn)物；7. 空白對(duì)照Bvi-f和Bvip-r2.1：Goat 2 by Bvi-fshang and Bvip-r;2：Goat 6 by Bvi-fshang and Bvip-r; 3: Negative control of DDW by Bvi-fshang and Bvip-r; 4: Maker DL2000; 5:Goat 2 by Bvi-f and Bvip-r2;6: Goat 6 by Bvi-f and Bvip-r2; 7: Negative control of DDW by Bvi-f and Bvip-r2.

從51份陽性樣本中隨機(jī)抽取9份PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并用Mega 5.0進(jìn)行序列拼接，獲得1 596 bp基因序列，將其遞交NCBI網(wǎng)站獲得序列號(hào)KC429038，與GenBank中已注冊(cè)的基因序列經(jīng)Blast對(duì)比顯示：與呂氏泰勒蟲全長(zhǎng)T.luwenshuni(JX469518)最接近，僅存在一個(gè)堿基差異；與從中國(guó)青海省羊標(biāo)本中檢測(cè)到的泰勒蟲Theileriaspp. China 1(AY262119)有5個(gè)堿基差異；與綿羊泰勒蟲T.ovis(FJ603460)同源性為97%；與尤氏泰勒蟲T.uilenbergi(JF719835)同源性為96%。將吉林報(bào)道的459 bp序列Theileriaspp.18S-Jilin(沒有在GenBank注冊(cè)，僅在文中列出)經(jīng)過分段比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與本研究得到的序列、Theileriaspp. China 1以及呂氏泰勒蟲相對(duì)應(yīng)的位置沒有任何差異。而與上述其他種類差異較大，為25～30個(gè)堿基。

圖2 基于泰勒蟲18S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees were performed based on 1 600 bp of 18S rRNA genes of Theileria spp.前加“*”為本研究所獲序列。The sample in present study has noted with asterisk “*”.

將合并后的1 596 bp序列與GenBank中的18S rRNA核苷酸序列進(jìn)行同源性比較并用NJ法(bootstrap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2中可以看出，陽性樣本序列與呂氏泰勒蟲T.luwenshuni位于同一小分支(圖2)。

3 討論

自1958年在我國(guó)四川報(bào)道羊泰勒蟲病后，本病在青海、甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古、陜西、河北、寧夏、新疆等地均有陸續(xù)報(bào)道。另外，我國(guó)東北吉林地區(qū)也是重要的畜牧區(qū)，有文獻(xiàn)報(bào)道該地區(qū)羊泰勒蟲病的感染率為29.23%(田萬年等，2008a)。然而，在本次研究中，吉林省山羊泰勒蟲的感染率為72.9%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于之前報(bào)道的陽性率。說明本病在該地區(qū)已對(duì)養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅,相關(guān)部門應(yīng)予以重視，采取有效措施以控制該病的進(jìn)一步蔓延。之前，有研究者通過459 bp基因片段檢測(cè)確認(rèn)東北吉林地區(qū)羊泰勒蟲分離株為Theileriaspp. China 1型(田萬年等，2008b)，沒有準(zhǔn)確定種。此次我們應(yīng)用PCR方法獲得近1600 bp左右，經(jīng)序列分析與呂氏泰勒蟲最接近，僅相差一個(gè)堿基。深入比較分析吉林報(bào)道的459 bp序列Theileriaspp.18S-Jilin，發(fā)現(xiàn)其與本研究得到的序列、Theileriaspp. China 1以及呂氏泰勒蟲相對(duì)應(yīng)的位置沒有任何差異，說明這三個(gè)來源標(biāo)本的泰勒蟲在這個(gè)基因區(qū)段相對(duì)保守，不足以區(qū)分Theileriaspp. China 1以及呂氏泰勒蟲，根據(jù)459 bp基因把吉林流行株確認(rèn)為與羊泰勒蟲China 1 株100%同源性，值得商榷，很可能，這一株還是呂氏泰勒蟲蟲株。結(jié)合本研究中羊泰勒蟲的感染率(72.9%)和用18SrRNA基因擴(kuò)增出的山羊血液中泰勒蟲基因型為呂氏泰勒蟲，可以初步說明，在該地區(qū)在引起羊泰勒蟲病的優(yōu)勢(shì)蟲株為呂氏泰勒蟲，且普遍存在。對(duì)于功能基因、血清學(xué)方面以及泰勒蟲形態(tài)學(xué)方面的證據(jù)，我們會(huì)在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。

有文獻(xiàn)報(bào)道在可以感染羊的泰勒蟲中，萊氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲致病力最強(qiáng)，呂氏泰勒蟲次之，綿羊泰勒蟲、隱藏泰勒蟲和分離泰勒蟲致病性很弱或無致病性(Alanietal., 1988; Yinetal., 2007)。此次在山羊中檢測(cè)到的為呂氏泰勒蟲，雖然沒有表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，但足以引起我們對(duì)預(yù)防和控制該地區(qū)山羊中泰勒蟲病的高度重視。