晏 強(qiáng) 姜 華 眭維國 羅 皓 王?，?梁桂榮 鄒貴勉 陳懷周 鄒和群

在不同腎臟疾病中，包括慢性移植腎失功(CRAD)，慢性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腎單位進(jìn)行性丟失的共同病理過程［1］。在炎癥性腎臟疾病中(包括CRAD)，核因子κB(NF-κB)的活化是一個重要的細(xì)胞信號事件，它控制著一系列炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。目前，已經(jīng)有大量研究表明糖原合成酶激酶 3β(GSK-3β)是 NF-κB 活化必不可少的要素［2，3］。尚無研究顯示GSK-3β和NF-κB在抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(ABMR)患者移植腎組織中的表達(dá)情況，因此，本研究主要通過免疫組化方法對ABMR導(dǎo)致CRAD的移植腎組織中GSK-3β、NF-κB的表達(dá)進(jìn)行檢測，并分析它們與腎間質(zhì)纖維化/小管萎縮(IF/TA)分級的關(guān)系，探討其在ABMR引起的CRAD發(fā)病機(jī)制中的作用，為移植腎慢性纖維化的發(fā)生和治療提供一定理論依據(jù)。

資料和方法

臨床資料 收集桂林解放軍第181醫(yī)院2002年01月至2013年04月住院的腎移植受者116例，其中尸體供腎98例，活體供腎8例，供受者腎移植術(shù)前均行乙型及丙型肝炎標(biāo)志物檢查為陰性，且術(shù)后復(fù)查亦均為陰性。術(shù)后出現(xiàn)肌酐爬行升高，反復(fù)蛋白尿定性檢查呈陽性(﹢﹢～﹢﹢﹢﹢)，定量檢查均≥0.20 g/24h，予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類降壓、活血護(hù)腎等處理，復(fù)查均未好轉(zhuǎn)。行移植腎穿刺活檢術(shù)，按照Banff 2009移植腎病理分級診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，病理診斷為 ABMR，包括 65 例男性，平均48±11歲;51例女性，平均42±8歲，腎穿時間為腎移植術(shù)后0.3～13.6年，血清肌酐563±137 μmol/L。其中58例接受環(huán)孢素+嗎替麥考酚酯+潑尼松三聯(lián)免疫抑制治療方案，58例接受他克莫司+嗎替麥考酚酯+潑尼松三聯(lián)方案治療。所有供、受者血型相同，抗供者特異性抗體(DSA)檢測陰性，群體反應(yīng)性抗體(PRA)＜10%，淋巴細(xì)胞毒交叉配型試驗(CDC)＜10%，HLA-A、HLA-B、HLA-Dr位點至少有二個位點相配。對照組為10例正常腎組織(年齡19～53歲)零點穿刺標(biāo)本病理檢查無異常。

病理分級診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)Banff 2009移植腎病理分級診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，將移植腎IF/TA的嚴(yán)重程度分為:Ⅰ級輕度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(＜25%的皮質(zhì)受累);Ⅱ級中度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(26%～50%的皮質(zhì)受累);Ⅲ級重度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(＞50%的皮質(zhì)受累)。

ABMR 診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］:C4d 陽性，循環(huán)中存在DSA，慢性組織損傷的形態(tài)學(xué)證據(jù)，如腎小球基膜雙軌征和(或)腎小管周圍毛細(xì)血管基膜多層和(或)IF/TA和(或)動脈纖維性內(nèi)膜增厚。

腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤程度分度:輕度(少量散在炎癥細(xì)胞浸潤);中度(炎癥細(xì)胞呈局灶性浸潤);重度(大片、彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤)。

免疫組化染色

GSK-3β免疫組化染色 采用EnVision法，石蠟切片3μm，常規(guī)烤片，脫蠟至水，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶，GSK-3β經(jīng)微波修復(fù)15 min。滴加一抗(兔抗人GSK-3β多克隆抗體，1∶100稀釋，武漢博士德公司產(chǎn)品，編號BA-0906)，4℃過夜，PBS液沖洗，滴加二抗(福州邁新公司提供)，37℃溫箱孵育30 min，PBS液沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。

NF-κB p65免疫組化染色 采用EnVision法，石蠟切片3μm，常規(guī)烤片，脫蠟至水，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶，10 mmol/L檸檬酸鈉(pH 6.0)緩沖液修復(fù)抗原，煮沸20 min。滴加一抗(鼠抗人 NF-κB p65 單克隆抗體，1∶100稀釋，Santa Cruz公司產(chǎn)品，編號ZS-8008)。余步驟同前。

RANTES免疫組化染色 采用EnVision法，石蠟切片3μm，常規(guī)烤片，脫蠟至水，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化氫酶，RANTES經(jīng)微波修復(fù)15 min，滴加一抗(RANTES兔抗人單克隆抗體，1∶200稀釋，武漢博士德公司產(chǎn)品，編號BA-1383)。余步驟同前。

單核趨化蛋白1(MCP-1)免疫組化染色 采用EnVision法，石蠟切片3μm，常規(guī)烤片，脫蠟至水，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶，MCP-1經(jīng)微波修復(fù)15 min。滴加一抗(兔抗人MCP-1單克隆抗體，1∶100稀釋，武漢博士德公司產(chǎn)品，編號 BA-1254)。余步驟同前。

C4d免疫組化染色 采用EnVision法，石蠟切片3μm，常規(guī)烤片，脫蠟至水，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化氫酶，C4d經(jīng)微波修復(fù)15 min。一抗為兔抗人C4d多克隆抗體(工作液，Santa Cruz公司，編號ZA-0415)，余步驟同前。

對照組 對照組以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。同時均行 Masson，PASM，IgA，IgG，IgM，C1q，C4c等免疫組化檢測。

結(jié)果評價 組織中C4d陽性標(biāo)準(zhǔn):腎小管周圍50%毛細(xì)血管呈線性沉積。組織標(biāo)本中RANTES、MCP-1及Ⅳ型膠原陽性標(biāo)準(zhǔn):腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺黃、棕黃、黃褐色顆粒。

免疫組化染色半定量分析 采用德國Leica(DMR+Q550型)真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，隨機(jī)選取10個不連續(xù)(避開腎小球和大血管)的腎小管間質(zhì)視野(×400)，每例腎小管總數(shù)＞60個。使用ImagePro-Plus 6.0軟件計算平均光密度，取其均值表示該種成分在腎小管和間質(zhì)的相對含量。

統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用 one way ANOVA，兩兩比較用LSD法(t檢驗);兩變量相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析;不同治療方案中的差異比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

組織學(xué)觀察 腎小球節(jié)段硬化，系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞及基質(zhì)中～重度增生，節(jié)段囊壁增厚、分層，基膜增厚，基膜呈連環(huán)樣改變和假雙軌征;腎間質(zhì)中度纖維化伴炎癥細(xì)胞浸潤，灶性單核細(xì)胞聚集;腎小管萎縮。

不符合急性排斥反應(yīng)、免疫抑制劑慢性腎毒性損傷、慢性腎小球腎炎等其他類型腎臟病病理改變。

C4d的表達(dá) 正常腎組織中C4d主要表達(dá)于的腎小球、腎小管基膜及系膜區(qū)，而在管周毛細(xì)血管(PTC)的內(nèi)皮細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)C4d沉積;在ABMR移植腎組織標(biāo)本中，C4d主要呈陽性表達(dá)于PTC的內(nèi)皮細(xì)胞(≥50%)。

GSK-3β的表達(dá) 在正常腎組織中，GSK-3β無表達(dá)或表達(dá)較低或。在ABMR患者移植腎組織中，GSK-3β的表達(dá)顯著增加，主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞胞質(zhì)中。隨著GSK-3β平均光密度的增加，IF/TA分級、NF-κB p65、RANTES和 MCP-1平均光密度亦增大，且呈正相關(guān)(r分別為 0.884、0.812、0.804 和0.788，P ＜0.001)，表明其表達(dá)水平亦隨之增加。GSK-3β的表達(dá)同炎癥細(xì)胞浸潤及血清肌酐水平亦呈正相關(guān)(r分別為 0.905 和 0.847，P ＜0.001)(表1、2，圖1、2)。

NF-κB p65的表達(dá) 正常腎組織中可在腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞偶見NF-κB p65表達(dá)。在ABMR患者移植腎組織中，NF-κB p65主要表達(dá)在包囊上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，表達(dá)水平較對照組明顯增加，其表達(dá)水平同炎癥性細(xì)胞因子RANTES、MCP-1及IF/TA分級呈正相關(guān)(r分別為 0.791、0.813 和0.914，P 均 ＜0.001)(表1，圖3);NF-κB p65的表達(dá)同炎癥細(xì)胞浸潤及血清肌酐水平亦呈正相關(guān)(r分別為 0.868 和 0.831，P ＜0.001)(表2，圖4)。

RANTES的表達(dá) 正常腎組織中的RANTES表達(dá)量低或無。在ABMR患者移植腎組織中RANTES大量表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜區(qū)及腎間質(zhì)內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞亦可見RANTES陽性細(xì)胞。腎小管損傷愈嚴(yán)重、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤愈多的部位，表達(dá)愈強(qiáng)。并且RANTES的表達(dá)隨著IF/TA的程度加重而增多，具有正相關(guān)性(r=0.888，P ＜0.001)(表1);RANTES 的表達(dá)同炎癥細(xì)胞浸潤亦具有正相關(guān)性(r=0.931，P＜0.001)(表2)。

MCP-1在腎組織中的表達(dá)和血清肌酐水平 正常腎組織中MCP-1表達(dá)較少。而在ABMR患者移植腎組織中，MCP-1表達(dá)顯著增加，主要位于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)、腎小球系膜區(qū)及毛細(xì)血管袢內(nèi)皮側(cè)，MCP-1與IF/TA病理分級亦呈正相關(guān)(r=0.868，P＜0.001)(表1)。ABMR患者血清肌酐升高的水平同纖維化程度分級的增加一致(r=0.898，P＜0.001);MCP-1的表達(dá)同炎癥細(xì)胞浸潤亦具有正相關(guān)性(r=0.897，P ＜0.001)(表2)。

GSK-3β、NF-κB p65、RANTES 和 MCP-1 在不同免疫抑制方案組間的表達(dá)情況在環(huán)孢素和他克莫司兩種為主的免疫抑制劑方案組之間GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1的表達(dá)無均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(表3)。

表1 在IF/TA不同病理分級中GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1陽性表達(dá)面積百分比及相應(yīng)SCr水平

表2 ABMR患者腎組織中GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1表達(dá)面積百分比和炎癥細(xì)胞浸潤的關(guān)系

圖1 ABMR移植腎組織中GSK-3β表達(dá)(↑)和IF/TA的關(guān)系

圖2 GSK-3β的表達(dá)和炎癥細(xì)胞(↑)浸潤的關(guān)系

表3 GSK-3β、NF-κB p65、RANTES和MCP-1在不同免疫抑制方案組間的表達(dá)水平

圖3 ABMR移植腎組織中NF-κB p65表達(dá)(↑)和IF/TA的關(guān)系

圖4 NF-κB p65的表達(dá)和炎癥細(xì)胞(↑)浸潤的關(guān)系

討 論

由于新型免疫抑制劑的應(yīng)用、圍手術(shù)期處理的改善，腎移植術(shù)后的近期效果已經(jīng)得到顯著改善，然而移植術(shù)后的長期生存率并不高。CRAD是移植腎功能衰竭的主要原因，包括:免疫和非免疫兩方面因素［5］，本研究主要圍繞其免疫因素ABMR展開。

已知炎癥細(xì)胞浸潤在腎臟的慢性炎癥和纖維化過程中發(fā)揮重要作用，炎癥反應(yīng)是腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的重要始動環(huán)節(jié)之一［6］，包括CRAD在內(nèi)，慢性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腎單位進(jìn)行性丟失的共同的病理過程［1］。有研究表明，巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞除了能分泌炎癥因子介導(dǎo)持續(xù)性的腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞損傷外，還能產(chǎn)生大量致纖維化因子(如 TGF-β、PDGF等)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生，導(dǎo)致腎臟纖維化;另外，巨噬細(xì)胞還能分泌金屬蛋白酶抑制物和纖維酶原激活物抑制劑，抑制ECM的降解，促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生［7］。我們的前期研究已經(jīng)證實，在CRAD患者移植腎組織中，GSK-3β的高表達(dá)同間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和IF/TA的發(fā)生密切正相關(guān)［8］。同時，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在ABMR引起的CRAD發(fā)病機(jī)制中，腎間質(zhì)炎癥和間質(zhì)纖維化的發(fā)生與GSK-3β和NF-κB p65的高表達(dá)密切相關(guān)。然而，GSK-3β和NF-κB p65如何介導(dǎo)ABMR引起的CRAD移植腎組織中炎癥細(xì)胞的浸潤和IF/TA的發(fā)生，尚未得到闡明。

GSK-3β是真核細(xì)胞生物體內(nèi)普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝，更重要的是能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、生長、突變及凋亡等生命活動，且在多種信號傳導(dǎo)過程中也起著重要的作用，當(dāng)GSK-3β(Ser9)磷酸化為pGSK-3β(Ser9)時失活。Gong等［9］在對 CRAD 的研究中證實，GSK-3β 在CRAD的炎癥反應(yīng)發(fā)生和調(diào)節(jié)促炎癥介質(zhì)NF-κB的活化過程中起著重要的作用。GSK-3β不但能夠調(diào)節(jié)NF-κB的活化，且是 NF-κB活化必不可少的要素［2，10，11］。已知 NF-κB 是眾多炎癥性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的共同調(diào)節(jié)蛋白，對人體最重要及通常所說的NF-κB是 p50/RelA(p50/p65)，其中 NF-κB p65 是其主要的功能亞基［12］。相關(guān)研究已證實，NF-κB的活化對于 RANTES［13］和 MCP-1［14］的表達(dá)非常重要，它能夠調(diào)節(jié)RANTES和MCP-1的表達(dá)，從而影響單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集和活化，在ECM的產(chǎn)生和腎臟纖維化的病程中起著重要的作用。

在本實驗中，GSK-3β在正常對照組腎組織中的表達(dá)較低或無，而在ABMR引起的CRAD移植腎組織中的表達(dá)明顯增高，主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞質(zhì)中，同非ABMR引起的CRAD相關(guān)研究一致［9］，且隨著IF/TA分級的增加表達(dá)增多;同時GSK-3β的升高與 NF-κB p65、RANTES、MCP-1 及血清肌酐的上升水平一致，具有正相關(guān)性(r分別為 0.812、0.804、0.788 和 0.847，P ＜0.001);NF-κB p65 主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞、包囊上皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，其表達(dá)水平同IF/TA分級的增加和血清肌酐升高呈正比(r分別為0.914 和0.831，P ＜0.001)(表1，圖2、4、6、8)。提示 GSK-3β 和 NF-κB p65 的異常高表達(dá)可能和ABMR引起的移植腎纖維化的發(fā)生和腎功能的惡化有關(guān)，故有必要進(jìn)一步探討GSK-3β和NF-κB在ABMR所導(dǎo)致的移植腎纖維化中的致病機(jī)制及相關(guān)臨床意義。

Schwabe等［15］研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65 的氨基酸序列包含了多個潛在的GSK-3β磷酸化的共同序列，RelA/p65是GSK-3β的同源底物，GSK-3β能夠通過磷酸化NF-κB p65而使其激活，從而促進(jìn)下游炎癥介質(zhì)RANTES和MCP-1基因的轉(zhuǎn)錄。而高選擇性的GSK-3β抑制劑可降低NF-κB p65的磷酸化和NF-κB依賴的炎癥介質(zhì)MCP-1的表達(dá)，減少包括腎臟在內(nèi)的多器官的損傷［16］。同時，Steinbrecher等［17］報道，在 GSK-3β敲除或抑制后的小鼠中，NF-κB DNA結(jié)合活性降低，且抑制了包括MCP-1、白細(xì)胞介素6在內(nèi)的眾多促炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。在內(nèi)毒素血癥所致急性腎衰竭模型中，GSK-3β抑制劑能夠抑制內(nèi)素素誘導(dǎo)的NF-κB的活化，抑制炎癥的發(fā)生，從而保護(hù)腎臟［18］?？梢?，GSK-3β主要是通過調(diào)節(jié)下游信號分子NF-κB p65的表達(dá)和磷酸化，進(jìn)而影響 NF-κB依賴的相關(guān)趨化因子 RANTES和MCP-1的表達(dá)，調(diào)節(jié)腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，在ABMR所致的CRAD移植腎中，隨著 GSK-3β、NF-κB p65、MCP-1 和 RANTES 表達(dá)的增加，間質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤亦隨之增多，它們之間具有正相關(guān)性(r分別為 0.905、0.868、0.897 和0.931，P ＜0.001)(表2，圖3、5、7、9)。高表達(dá)的GSK-3β主要通過誘導(dǎo)促炎癥介質(zhì)NF-κB p65的表達(dá)和活化，導(dǎo)致趨化因子MCP-1和RANTES的表達(dá)增加，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的浸潤和活化，促進(jìn) ECM的產(chǎn)生并抑制其降解，最終參與ABMR所致的CRAD的進(jìn)程中。另外，已知NF-κB的活化是α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)的始動因素，且α-SMA的出現(xiàn)是成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志［19］，肌成纖維細(xì)胞的生成可在腎間質(zhì)產(chǎn)生膠原等ECM成分。可見，NF-κB除了通過誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的浸潤，產(chǎn)生大量致纖維化因子外，還能夠促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的生成，合成大量的ECM，最終導(dǎo)致移植腎纖維化。

此外，通過比較兩種不同的免疫抑制治療方案發(fā)現(xiàn)，不同的治療方案對 GSK-3β、NF-κB p65、MCP-1和RANTES的表達(dá)無顯著影響(表3)。在ABMR引起CRAD的發(fā)病機(jī)制中，GSK-3β和NF-κB等促炎因子主要參與了相關(guān)炎癥細(xì)胞的浸潤和活化，與不同的免疫抑制方案無相關(guān)性，同時也提示，通過調(diào)整免疫抑制治療方案不能有效地阻斷GSK-3β/NF-κB信號通路，即不能阻斷炎癥反應(yīng)和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。

在以腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)［20］和間質(zhì)纖維化為主［21，22］的其他腎病模型中，通過抑制 GSK-3β 的表達(dá)證實GSK-3β發(fā)揮了重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，在ABMR導(dǎo)致的CRAD中，GSK-3β與移植腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤、活化和IF/TA的發(fā)生密切相關(guān)，提示，GSK-3β可成為減輕移植腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)和抗纖維化治療的潛在靶點，通過抑制移植腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)和IF/TA的發(fā)生，延長移植腎功能。

綜上所述，在ABMR引起的CRAD患者移植腎組織中，GSK-3β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了CRAD的病變過程，同CRAD的發(fā)展關(guān)系密切，移植腎組織主要表現(xiàn)炎癥反應(yīng)和IF/TA。GSK-3β在移植腎組織中表達(dá)較正常腎組織明顯增高，其主要通過誘導(dǎo)下游促炎癥介質(zhì) NF-κB的活化及相關(guān)炎癥介質(zhì)(RANTES和 MCP-1)的表達(dá)，介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)和IF/TA的發(fā)生和發(fā)展;作為GSK-3β的下游信號分子，NF-κB的激活介導(dǎo)了GSK-3β的促炎效應(yīng)和促進(jìn)了肌成纖維細(xì)胞的生成。因此，GSK-3β對于間質(zhì)炎癥的發(fā)生和ECM的合成有著重要的作用，對于治療炎癥損傷性慢性移植腎腎病、減少ECM的產(chǎn)生和預(yù)防移植腎丟失，GSK-3β可望成為一種新的治療靶點，在一定程度上為延長移植腎存活時間提供了一條新的途徑。

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