廖 倩，吳謖琦，孫修勤

（國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061）

機體的固有免疫系統(tǒng)在抵抗病毒感染方面發(fā)揮著重要作用。病毒感染宿主細胞后，宿主細胞可以通過模式識別受體（Pattern Recognition Receptors，PRRs）監(jiān)測病原相關(guān)分子模式（Pathogen－Associated Molecular Patterns，PAMPs）的存在，從而激活宿主的固有免疫反應(yīng)，誘導干擾素（Interferon，IFN）、促炎癥細胞因子等一系列抗病毒因子的產(chǎn)生。除了RLRs（RIG－I Like Receptors）之外，目前已發(fā)現(xiàn)的PRRs還包括：TLRs（Toll Like Receptors）、CLRs（C－type Lectin Receptors）以 及 NLRs（Nucleotide Oligomerization Domain－Like Receptors）等［1－2］。Toll樣受體家族是一類重要的PRRs，在病毒的識別過程中發(fā)揮重要作用，如TLR3識別dsRNA；TLR9識別病毒或細菌DNA包含的非甲基化CpG等。但由于TLRs家族成員均為跨膜蛋白，只能識別細胞外或靠近胞內(nèi)膜的病毒，對于細胞質(zhì)中的RNA病毒，TLRs則不易做出反應(yīng)。RLRs則是存在于胞漿中的1個具有Asp－Glu－X－Asp/His（DExD/H）特征基序的RNA解旋酶家族，能夠通過識別胞漿內(nèi)的病毒核酸，將信號傳遞給轉(zhuǎn)錄因子，從而活化I型干擾素的合成并誘導其它抗病毒相關(guān)基因的表達［1］。因此，RLRs在抗病毒免疫應(yīng)答方面具有極其重要的作用。

1 RLRs的結(jié)構(gòu)、功能及分布

目前已發(fā)現(xiàn)的 RLRs成員有3個，分別為視黃酸誘導基因I（Retinoic Acid－inducible Gene I，RIG－I）、黑色素瘤分化相關(guān)基因5（Melanoma Differentiation Associated Gene 5，MDA5）與LGP2（Laboratory of Genetics and Physiology 2）。上述3個分子具有相似的結(jié)構(gòu)，含有3個基本結(jié)構(gòu)域包括：1）N末端的CARD結(jié)構(gòu)域（Caspase Activation and Recruitment Domain，CARD），由1個或2個線性排列的CARDs串聯(lián)而成，為半胱天冬酶活化與招募結(jié)構(gòu)域（LGP2中缺失）；2）中間的解旋酶結(jié)構(gòu)域，屬于RNA解旋酶DExD/H家族，包含9個短的基序：Q，I，Ia，Ib，II～VI（基序I、II又分別稱為 Walker A、B模體）9個短的基序；3）C末端結(jié)構(gòu)域（C－terminal Regulatory Domain，CTD）。MDA5的CARD結(jié)構(gòu)域，解旋酶結(jié)構(gòu)域及CTD與RIG－I的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域之間的同源性分別為23%，35%，30%［3－4］。RIG－I的解旋酶結(jié)構(gòu)域及CTD與LGP2的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域之間的同源性分別為31%，29%。另外，MDA5的解旋酶結(jié)構(gòu)域及CTD與LGP2的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域之間的同源性則分別為41%，34%［5］。

RLRs的CARD結(jié)構(gòu)域通過與線粒體連接蛋白 MAVS（Mitochondrial Antiviral Signalling Protein）的CARD同源結(jié)合啟動下游信號傳導過程，從而在線粒體相關(guān)復合體處募集并活化更多的信號分子（LGP2由于缺失CARD結(jié)構(gòu)域因而不參與信號傳導過程）；解旋酶結(jié)構(gòu)域能夠水解ATP，同時與RNA結(jié)合（也可能促使RNA的解聚）；CTD可與dsRNA或5＇ppp－ssRNA結(jié)合形成共同結(jié)構(gòu)，并由此決定了不同RLRs與病毒RNA結(jié)合能力的強弱，同時在RIG－I中CTD結(jié)構(gòu)域還具有自我調(diào)節(jié)功能，即在缺少RNA配體的條件下，CTD與CARD間會形成一個緊密的結(jié)構(gòu)，從而阻止其下游信號的傳遞［3，6］。

RLRs通常在絕大多數(shù)組織的細胞中低量表達，在病毒和干擾素的刺激下RLRs的表達會迅速上調(diào)［3］。在小鼠和人的成纖維細胞、巨噬細胞和常規(guī)樹突細胞（Convential Dentric Cells，cDCs）中RIG－I為主要監(jiān)測細胞質(zhì)RNA病毒感染的分子［3］。在非極化上皮細胞中，RIG－I位于膜脊上，與細胞骨架上的F－肌動蛋白存在相互作用，而MDA5位于胞質(zhì)中，與肌動蛋白間無明顯的共分布，同時發(fā)現(xiàn)RIG－I在極化上皮和內(nèi)皮細胞的頂端結(jié)點也有分布，而MDA5則無此分布［6］。

2 RLRs對外源核酸的識別

無論是先天免疫或是適應(yīng)性免疫，其核心均在于對免疫原的正確識別。RLRs能夠直接識別RNA病毒核酸并產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答，而對DNA病毒核酸則需經(jīng)RNA聚合酶Ⅲ作用產(chǎn)生5′ppp－ssRNA后才能間接識別。與RNA結(jié)合后，RIG－I與MDA5經(jīng)過ATP依賴型的構(gòu)象變化，其N末端的CARD暴露且誘導寡聚化，使得CARD與線粒體連接蛋白MAVS（也稱IPS－1，VISA或Cardif）的CARD相互作用而起始下游信號的傳遞［3］。

2.1 RLRs對RNA病毒的識別

盡管RIG－I與MAD5的結(jié)構(gòu)相似，但其識別的病毒卻明顯不同。目前的研究顯示，MDA5主要識別小RNA 病毒如腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）、腦脊髓炎病毒（Theiler＇s murine encephalomyelitis virus，TMEV）、門戈病毒（Mengo virus，MV）及相對長的polyI：C（大于2kb）；RIG－I主要識別的RNA病毒包括甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV），水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV），新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV），呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）等及相對短的polyI：C（通常小于1kb）。同時也存在部分病毒都能被RIG－I及 MDA－5識別，如登革病毒（Dengue virus，DEN），西尼羅河腦炎病毒（West nile virus，WNV）和呼吸道腸道病毒（Reovirus，RV）。這表明 RIG－I與MDA5在功能上有部分重合的［3］。

對于特定病毒的識別，RIG－I與MDA5呈現(xiàn)高度的細胞特異性。在受仙臺病毒（Sendai virus，SeV）感染的MEFs細胞中，SeV由RIG－I來識別，而在cDCs中，主要由MDA5負責SeV的識別［7］。然而關(guān)于細胞對病毒特異性的識別是由受體的差異性表達引起，還是由不同細胞中病毒復制的差異性引起的機制目前尚不明確。

從病毒的本質(zhì)來看，RIG－I特異性的結(jié)合5′ppp－ssRNA，從而產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答［8］。然而，不同學者的實驗表明5′ppp－ssRNA需要堿基配對結(jié)構(gòu)才能通過RIG－I活化抗病毒信號途徑，且此RNA的結(jié)構(gòu)為短的平末端5′ppp－dsRNA［3］。因為在負鏈RNA病毒的單鏈基因組的鍋餅結(jié)構(gòu)域含5′三磷酸的平末端短雙鏈RNA，所以，RIG－I可以檢測的負鏈RNA病毒［3］。由于小RNA病毒的基因組RNA及其復制中間體RNA的5′末端不被磷酸化，其是與一種小蛋白Vpg共價結(jié)合，所以小RNA病毒是由 MDA5而非RIG－I識別的［8］。

從病毒的免疫逃逸角度也可看出RLRs的抗病毒感染中的作用。在EMCV感染過程中，病毒編碼的3C蛋白酶與半胱氨酸蛋白酶共同作用可致RIG－I降解，因此阻斷了細胞的抗病毒途徑［9］。另外，在脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus，PV）感染的細胞中，MDA5可被蛋白酶體、半胱氨酸蛋白酶而非蛋白酶2A或3C的作用下降解［10］。這被認為是病毒演化出的一種抵抗因病毒感染誘導宿主細胞產(chǎn)生I型IFN，有利于病毒的增殖的機制。甲型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白可與RIG－I相互作用，進而阻斷了RIG－I的抗病毒信號實現(xiàn)了病毒的逃逸［8］。HCV則通過編碼蛋白酶NS3/4A作用于宿主細胞MAVS的C端，使MAVS不能在線粒體上發(fā)生寡聚化進而阻斷RIG－I信號通路，造成細胞不能傳遞病毒入侵的信號［3］。

哺乳動物中LGP2可影響RIG－I和MDA5對RNA病毒的識別。當LPG2缺失時，RIG－I和MDA5誘發(fā)的抗病毒效應(yīng)都會減弱［11］。但另一方面也有研究顯示LGP2可作為抗病毒效應(yīng)的反饋抑制子與MAVS形成復合物，從而抑制RIG－I與 MDA5誘發(fā)的抗病毒效應(yīng)［12］。此外，另有研究發(fā)現(xiàn)LGP2對EMCV和VSV的感染分別起著相反的作用，即LGP2對MDA5和RIG－I的抗病毒應(yīng)答分別起到正負調(diào)控的作用［13］。Pippig Diana A.等［14］發(fā)現(xiàn)LGP2的RNA結(jié)合區(qū)結(jié)合能力最強，而MDA5的最弱，并提出了LGP2對RIG－I及MDA5的調(diào)節(jié)模型：dsRNA結(jié)合至LGP2的C末端及DExH基序，從而競爭性抑制了dsRNA依賴的RIG－I的激活：完整的LGP2又可以與 MDA5共同識別dsRNA以增強MDA5介導的信號轉(zhuǎn)導。雖然LGP2對其它RLRs的調(diào)控作用目前還沒有定論，但上述結(jié)果明確說明LGP2在RLRs所組成的抗病毒體系中也起到了重要的作用。

2.2 RLRs對DNA病毒的識別

正常細胞需要合成自身所需的RNA，但這種RNA需要經(jīng)過多種不同方式的加工，才能保護了正常產(chǎn)物不被RIG－I或MDA5所識別，如mRNA需要在5′端加上7－甲基鳥苷、tRNA經(jīng)過5′切割和一系列核苷酸的修飾、rRNA與核糖體蛋白結(jié)合成為核糖核蛋白體等。然而，無論是由于感染而新進入的病毒RNA，還是由于病毒復制而產(chǎn)生的RNA都包含著非自身的標記5′三磷酸。因此，由DNA病毒產(chǎn)生的5′ppp－ssRNA可能被RIG－I很好的檢測。

研究表明HEK293細胞中，胞漿dsDNA誘導IFN－β的產(chǎn)生被MAVS的基因沉默部分抑制，說明MAVS在人類細胞中可能介導了dsDNA的信號傳導［15］。在Huh－7細胞中RIG－I及MAVS在對于dsDNA誘導的IFN－β啟動子的活化是必需的。進一步蛋白質(zhì)相互作用的Pull down分析結(jié)果表明RIG－I雖然介導了dsDNA的信號級聯(lián)反應(yīng)，但可能并不直接與dsDNA結(jié)合，而是依靠上游信號分子識別dsDNA，然后通過RIG－I的信號傳導途徑誘導IFN－β的表達［16］。與之對應(yīng)，Andrea Ablasser等［17－18］發(fā)現(xiàn)了1條與 RNA 聚合酶III（RNA Polymerase III RNA Pol－III）及RIG－I相關(guān)的DNA病毒識別途徑，在此途徑中富含AT的dsDNA作為RNA Pol－III的模板，轉(zhuǎn)錄成含5′三磷酸的dsRNA，進而活化RIG－I并誘導I型干擾素的產(chǎn)生同時活化轉(zhuǎn)錄因子NF－κB。因此，RNA聚合酶III及RIG－I對于病毒DNA的識別至關(guān)重要。

進一步研究發(fā)現(xiàn)人類細胞中也存在RNA Pol－III MDA5DNA識別途徑［19］。另外，在lgp2－/－MEFs細胞中，胞漿dsDNA分子poly（dA－dT）轉(zhuǎn)染進入細胞后，與野生型細胞相比，LGP2的缺失減弱了細胞對poly（dA－dT）等的反應(yīng)。體外研究也發(fā)現(xiàn)LGP2蛋白并不與DNA結(jié)合，而是間接介導了細胞對DNA的反應(yīng)，這表明LGP2也可能通過胞內(nèi)RNA Pol－III途徑產(chǎn)生免疫應(yīng)答［20］。以上研究表明，RLRs很可能都通過RNA Pol－III的識別在DNA病毒的識別應(yīng)答中起重要作用。

3 RLRs的信號傳導途徑

盡管RIG－I與MDA 5識別的對象有所差異，但它們都遵從相同的信號傳導途徑。RLRs信號通路的第1個下游接頭分子是線粒體連接蛋白MAVS［21］。MAVS通過其不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠與一系列信號分子發(fā)生相互作用，如 FADD（Fas－Associated Death Domain－containing）和 RIP1（Receptor－Interacting Protein 1），TRAF2（Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor 2），TRAF6（Tumor Necrosis Factor Recepetor Associated Factor 6），TRAF3（Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor 3），MITA（Mediator of IRF 3Activation）等，通過IRF3（Interferon Regulatory Factor 3），IRF7（Intorferon Regulatory Factor 7），NF－κB級聯(lián)傳遞，最終誘導促炎癥細胞因子和I型干擾素的表達［21－28］。RLRs的基本信號通路如圖1所示。

圖1 RLRs的信號傳導通路Fig.1 RLRs－mediated signaling pathway

RIG－I與MAD5作為胞漿內(nèi)核酸受體可識別胞漿的RNA分子，與下游信號分子MAVS相互作用，招募 TRAF3，TRAF2，CARD9（Caspase Recruitment Domain－Containing Protening 9），F(xiàn)ADD 及RIP1，MITA等下游接頭分子［21－28］。激活的TRAF3，MITA通過TBK1－IKKi，IRF3和IRF7活化激酶激活轉(zhuǎn)錄因子活化IRF3及IRF7［24，26］。激活的 TRAF2，CARD9則分別通過與 TAK1－IKK，BCL10（B－cell lymphoma 10）的作用活化 NF－κB［21，23］。激活的FADD及 RIP1則直接活化 NF－κB［21］。IRF3，IRF7及 NF－κB的活化誘導促炎癥細胞因子和I型干擾素的表達，以抵抗病毒的感染［3］。其中，MITA位于線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與E3泛素連接酶RNF5的泛素化作用有關(guān)［24］。不同學者研究中，TRAF6在信號途徑中的作用出現(xiàn)不一致的結(jié)果，因此需要進一步的實驗加以確認。

其中，MAVS是1個同樣具有CARD基序的膜結(jié)合蛋白。除了CARD基序外，MAVS還有富含脯氨酸的中間區(qū)域，以及C端的疏水跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane Domain，TM）［29］。剔除實驗分析顯示MAVS的CARD結(jié)構(gòu)域和TM（可使MAVS其定位于線粒體外膜）結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄湫盘杺鲗Чδ芏际潜匦璧模?1］。同時，據(jù)最新報道稱，MAVS在線粒體上通過其C端形成的寡聚化，此寡聚化對于MAVS向下游傳遞信號也是必需的［30］。MAVS與RIG－I或MDA5之間同源CARD－CARD特異性的相互作用啟動了信號傳導途徑。

4 RLRs與其它抗病毒免疫途徑的交聯(lián)

如前所述，RLRs并不是產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答的唯一途徑，而是與其它PRRs一同相互協(xié)調(diào)提供機體對病毒的免疫保護。黃病毒（Flavivirus）中的WNV感染小鼠很好地體現(xiàn)了不同PRRs之間的相互協(xié)調(diào)作用。WNV病毒感染初期進入皮中的朗罕式細胞和/或成纖維細胞，感染細胞的RLRs誘導局部IFN的分泌及其它先天免疫應(yīng)答，進而控制病毒進入外周血。然而，一旦病毒突破皮膚屏障進入引流淋巴結(jié)中的巨噬細胞和cDCs進行復制，這些細胞的RLRs，TLRs就會啟動多種IFN與促炎癥細胞因子的合成，因而形成局部的炎癥反應(yīng)。RLRs在應(yīng)答中是監(jiān)控WNV感染并觸發(fā)胞內(nèi)先天免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，而TLRs則是產(chǎn)生特定細胞因子并啟動適應(yīng)性免疫的根源。TLRs及多種輔助因子的表達受到IFN的調(diào)控。因此，起始的RLRs信號傳導及IFN的合成對于強化TLRs的表達及其免疫效應(yīng)有重要作用。RLRs途徑通過影響MyD88依賴的信號途徑介入到TLRs的抗WNV病毒感染過程［31－32］。另有研究發(fā)現(xiàn)MAVS可參與到TLR3的下游信號途徑中，這進一步說明RLRs與TLRs信號途徑間存在關(guān)聯(lián)［28］。

由此可見，機體的抗病毒感染都是通過多種免疫途徑實現(xiàn)的，而不同途徑之間存在復雜的協(xié)調(diào)關(guān)系，以確保生物體產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答。

5 魚類RLRs的研究進展

在魚類中，RIG－I的研究最早在大西洋鮭魚（Salmosalar）細胞系TO及鯉魚（Cyprinuscarpio）細胞EPC中進行。Stéphane Biacchesi等［1］鑒定了編碼 RIG－I樣分子及 MAVS的序列，且證實 RIG－I、MAVS在這些細胞中的過量表達誘導了IFN及IFN誘導基因的表達，從而實現(xiàn)了細胞對RNA病毒感染的完全保護，同時證明了TO細胞中MAVS位于線粒體膜上。隨后，在草魚（Ctenopharyngodonidella），金魚（Carassiusauratus）中也克隆出RIG－I基因，并從mRNA水平及魚類細胞的病變兩方面研究了RIG－I在抗病毒中的作用［33－34］。MDA5及 LGP2 基因也相繼在草魚、牙鲆（Paralichthysolivaceus）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）及金魚中被克隆出來，并對它們在抗病毒中的作用進行了初步研究［35－37］。另外，在虹鱒魚中發(fā)現(xiàn)了1個截短形式的LGP2異構(gòu)體，其在LGP2的信號傳導中起負調(diào)控的作用。與哺乳動物LGP2調(diào)控MDA5信號途徑的功能不同，虹鱒魚的LPG2與MDA5可能在抗病毒反應(yīng)中獨立發(fā)揮作用［38］。在斑馬魚（Danio rerio）、草魚、大西洋鮭、牙鲆及虹鱒中也先后發(fā)現(xiàn)了MAVS基因，但斑馬魚MAVS基因沒有表現(xiàn)出特異定位于某個亞細胞器的特征，這可能是因為斑馬魚MAVS基因缺失了人同源基因的C端跨膜結(jié)構(gòu)域［38－39］。這些結(jié)果說明魚類的MAVS細胞分布可能與哺乳動物有所不同。

6 展望

RLRs作為新發(fā)現(xiàn)的PRRs，其在病毒核酸識別中的重要性已經(jīng)得到證實，但仍有許多問題尚待解決。首先，在RLRs途徑中，LGP2對RIG－I與MDA5中起到了正或負調(diào)控的作用，它是如何確定調(diào)控作用的方向，這其中的機制急需解決以更加完善RLRs抗病毒信號通路。其次，已知RIG－I與MDA5對不同的RNA病毒起到識別作用，而有證據(jù)表明同一病毒對不同細胞的感染分別由RIG－I與MDA5來識別，這些細胞是如何決定何受體發(fā)揮作用的，RIG－I與MDA5是如何分工，需要更進一步的研究加以明確。另外，我們需要了解RLRs與TLRs信號途徑對不同病毒的識別應(yīng)答是如何協(xié)作以實現(xiàn)機體更好的自我保護的。為了明確RLRs通過RNA Pol－III的識別在不同DNA病毒的識別應(yīng)答中起重要作用，更多的研究需要我們?nèi)ミM行。

魚類是已知兼具固有與獲得性免疫最低等的脊椎動物，也具有完全的體液和細胞免疫應(yīng)答。魚類屬于變溫動物，淋巴細胞的增殖較為緩慢，獲得性免疫應(yīng)答的發(fā)生相對滯后（可長達12周）。另外，在進化上魚類的免疫系統(tǒng)也不如高等動物完善，抗體的親和力、抗體庫的大小均明顯低于哺乳類，這些決定了魚類的固有免疫系統(tǒng)在抵抗病原體感染的免疫應(yīng)答中作用比哺乳動物更為重要。如前所述，RLRs在哺乳動物中的研究相對豐富，而目前在魚類RLRs領(lǐng)域的研究資料仍相當匱乏。作為控制病毒感染的關(guān)鍵途徑，魚類RLRs相關(guān)的基礎(chǔ)研究不僅對于經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類病毒性疾病的免疫防治研究方面具有重大意義，同時還由于魚類在進化中的特殊地位，使其對完善以高等哺乳類為基礎(chǔ)建立起來的免疫學知識具有重要作用。隨著魚類研究在細胞培養(yǎng)、蛋白質(zhì)組、基因組等技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，對魚類RLRs信號傳導途徑及其分子機制的深入研究將為重大傳染性疾病的免疫防治、新型藥物的開發(fā)以及高等生物抗病毒免疫體系等方面提供重要的科學依據(jù)。

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