楊 春，欒新杰，趙美鳳，胡效亞

(揚州大學 化學化工學院，江蘇 揚州 225002)

分子印跡聚合物(MIPs)是在特殊模板分子存在下制備的材料［1］，當除去模板分子后，該聚合物具有選擇親和性，能夠吸引或識別原來的模板。MIPs在諸如傳感器［2］、催化［3－5］、分離［6－8］、分子識別［9－11］、抗體模擬［12］以及晶體工程［13］等領域發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)印跡聚合物通常按照非共價方法合成［14－17］。低位阻的 MIP 由表面印跡［18－19］、納米印跡［20］或凍膠［21］技術(shù)得到。這些材料能夠保證模板與最終聚合物之間的快速吸附－脫附平衡。

復雜蛋白質(zhì)分析，尤其是蛋白質(zhì)組學研究中，降低樣品的復雜性非常重要。到目前為止，很少有方法在脫除高豐度蛋白質(zhì)的同時，能夠富集樣品中的低豐度組分。一種名為“固態(tài)配體庫”(Solidphase ligand library)的方法，可從復雜樣品中同時萃取高、低豐度蛋白質(zhì)，具有降低主要成分、同時濃縮低豐度成分的作用［22］。但此法有一定局限性，必須根據(jù)樣品性質(zhì)設計、合成特殊的配體庫。

本文研究了一種蛋白質(zhì)印跡聚合物的新合成方法，既不使用標準蛋白質(zhì)，也無需合成任何配體。在樣品(雞蛋清)存在下，基于凍膠方法合成聚合物。聚合物在毛細管中形成，從而得到整體柱。同時在相同條件下合成了一根對比柱。通過對比研究，發(fā)現(xiàn)樣品中多個高豐度組分被印跡，印跡整體柱可從樣品溶液中特異地吸附作為印跡模板的高豐度組分，同時增強低豐度蛋白質(zhì)的信號。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HPCE-10型毛細管電泳儀(大連江申分離科學儀器公司)，紫外吸收檢測器，采用電滲流進樣;毛細管(內(nèi)徑100 μm，外徑365 μm)購自河北省永年銳灃色譜器件有限公司;緩沖溶液為10 mmol/L(pH 8.2)的 Na2HPO4。

丙烯酸、烯丙基胺、丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS，98%)購自山東鵬浩化工;N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)購自國藥化學試劑公司(上海);其他試劑均為分析純。

樣品的配制:取鮮雞蛋蛋清，溶于8倍體積的磷酸鹽緩沖液，輕搖至蛋清溶解，過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 印跡、非印跡聚合物整體柱的制備

毛細管預處理方法:取一定長度的毛細管，分別用0.1 mol/L的NaOH溶液和蒸餾水依次沖洗40 min，注入γ-MAPS(50%體積分數(shù)的甲醇溶液)浸泡40 min，N2吹干，120℃恒溫干燥3 h。

表1 單體溶液配比Table 1 Composition of the monomer solution (g/100 mL)

按照表1稱取所需量的單體溶液溶于水，超聲至完全溶解。用注射器將單體溶液分別引入毛細管中。封閉毛細管兩端并置于－20℃冰箱中，24 h后取出置于50℃水浴中10 h。

1.3 整體柱的沖洗與印跡整體柱的再生

緩沖液使用前超聲脫氣10 min。整體柱每次實驗前沖洗5～10 min。對比柱使用緩沖溶液沖洗，印跡柱使用含有3%SDS的緩沖溶液沖洗，并在90℃下至少保持15 min，之后再用緩沖溶液沖洗5 min，以徹底脫去印跡模板蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)分子待定模板印跡方法

理論上，在合成印跡聚合物時，將一個樣品加入單體溶液中，若樣品濃度高于某個值(印跡濃度閾值)，則某些組分可作為模板分子被印跡。最先被印跡的是最高濃度組分，樣品中某組分的濃度越高，被印跡的幾率越高，反之亦然。樣品濃度低于印跡濃度閾值則任何組分均不被印跡。通過調(diào)節(jié)樣品的濃度，可以改變樣品的印跡行為，即在樣品濃度確定之前，被印跡的組分種類及數(shù)量均未確定。因此，該方法也稱作“待定模板印跡”方法。

待定模板印跡方法對于復雜樣品的分析具有特別意義。例如在蛋白質(zhì)組學研究中，從體液、細胞或器官中提取的樣品通常非常復雜，往往含有成百上千的蛋白質(zhì)。從這些樣品中除去高豐度組分，進而分析低濃度的生物標記物或特殊功能性分子，是一項耗費大量時間及經(jīng)費的工作。在此情況下，待定模板印跡方法的出現(xiàn)將大大簡化復雜樣品的處理過程。

待定模板印跡的要點是組分部分印跡，即得到的聚合物對樣品中高豐度組分具有特異親和性。當從聚合物中除去模板分子，并再次作用于原樣品時，印跡聚合物能選擇性地吸附部分組分(模板)，從而將樣品分成兩部分，一部分吸附于固體上，另一部分留在溶液中(圖1)。通過調(diào)節(jié)樣品的濃度，可以改變吸附、溶解兩相組分的相對含量，從而得到一系列復雜性不同的“次級樣品”，而每一“次級樣品”中所含組分都比原樣品簡單。如果“次級樣品”比較復雜，則可以將其作為新的“不定模板”，實施次級印跡(圖1標出了第二代印跡)。理論上此過程可以一直進行，直到發(fā)現(xiàn)感興趣的目標分子，或?qū)⑵湎拗频揭粋€足夠簡單的“餾分”中。

圖1 蛋白質(zhì)分子待定模板印跡聚合物與原樣品的作用過程Fig.1 Schematic presentation of the interaction of the sample and imprinted polymer without standard templates

2.2 聚合物的特點

本文合成的聚合物是兩性電解質(zhì)冰膠，其特點是同時含有酸性和堿性基團，并具有超大孔結(jié)構(gòu)。

同時使用酸、堿性單體制備蛋白質(zhì)分子印跡聚合物的文獻報道并不多見［23］。蛋白質(zhì)分子由氨基酸聚合而成，本身是兩性物質(zhì)，因此作為印跡蛋白質(zhì)分子的聚合物，兩性電解質(zhì)可比相似的酸性、堿性聚合物提供更多的相互作用位點，因而其印跡效果應該更加顯著。實驗發(fā)現(xiàn)聚合物與模板間的親和性相當強，其洗脫液中必須添加SDS，且須在加熱的條件下才能順利實現(xiàn)脫附。另一方面，為了改善分離柱的通透性及提高分離速度，采用了具有超大孔結(jié)構(gòu)的冰膠聚合物。

圖2 聚合物整體柱的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of the polymers

單體溶液中，添加了比一般冰膠法含量多(～30%，表1)的交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺。與丙烯酰胺相比，該交聯(lián)劑疏水性稍強，形成的聚合物并非彈性膠狀物，而是呈現(xiàn)蓬松多孔狀結(jié)構(gòu)。印跡與對照聚合物在外觀上并無明顯差異，只是印跡聚合物略顯稠厚。圖2是印跡聚合物(MIP)、對照聚合物(NIP)整體柱的掃描電鏡圖，外觀上兩種聚合物十分相似。

2.3 蛋白質(zhì)在印跡、非印跡聚合物整體柱中的電泳

高豐度組分與單體相互作用，進而被印跡到聚合物中。當它們被除去后，聚合物中將留下親和性空隙或位點，以此為基礎的聚合物整體柱在樣品分離中將顯示出有趣的結(jié)果。

從圖3可見，無論印跡柱還是對照柱(非印跡柱)，都可實現(xiàn)雞蛋清樣品的快速分離。對照柱中電泳實驗在16 min之內(nèi)完成，圖中清楚地呈現(xiàn)出6個以上的峰(圖3A)，代表樣品中的高豐度組分。經(jīng)與標準蛋白質(zhì)電泳譜圖對比，發(fā)現(xiàn)15 min附近的峰為卵清蛋白，2.5 min的峰為溶菌酶。由于標準品有限，其他譜峰未能定性。

圖3 雞蛋清蛋白質(zhì)在非印跡柱(A)與印跡柱(B)中的電泳圖Fig.3 Electropherograms of chicken egg proteins on non-imprinted column(A)and sample-imprinted column(B)

對照樣品在兩根柱中的分離結(jié)果(圖3)，發(fā)現(xiàn)有幾個主要蛋白質(zhì)的峰信號出現(xiàn)消失或降低現(xiàn)象。除卵清蛋白(15 min)外，8、13 min處的譜峰消失，11.5 min處的峰高、峰面積大幅降低(圖3B)。溶菌酶(2.5 min)的信號幾乎消失。由此可見，印跡聚合物中存在針對高豐度組分的吸附位點，而這正是在聚合物的形成過程中高豐度組分的印跡行為造成的。雖然部分組分的譜峰降低或消失，但印跡柱中總的峰數(shù)目增加，主要集中在4～10 min之間(圖3B)。這是由于印跡柱中存在特異性吸附位點，能夠保留原來作為模板的部分高豐度組分，使其信號降低甚至消失;低豐度組分在單體溶液中濃度未達到印跡閾值，未發(fā)生印跡，聚合物中不存在相應特異性吸附位點，因此這些組分表現(xiàn)出快速遷移行為。在印跡聚合物柱中的進樣量是對比柱中的2倍，所以部分低豐度組分的譜峰清晰可見(圖3B，4.5～8 min)。

3 結(jié)論

待定模板印跡方法可以對復雜樣品中的高豐度組分實施印跡而無需標準物質(zhì)作為模板，形成的聚合物具有特異性吸附高豐度組分功能，從而為復雜樣品的分離、分析提供了新的思路及操作技術(shù)。待定模板印跡聚合物通過捕獲高豐度組分而增強低豐度組分的信號，這意味著它們可以用來從復雜樣品中脫除高豐度組分，從而大幅度降低樣品復雜性，便于進一步分析處理，且可方便地對低豐度組分進行濃縮富集。根據(jù)待定模板印跡原理可發(fā)展快捷、簡便、低成本的樣品處理及分離、分析方法，有望在復雜對象(如:蛋白質(zhì)組學、醫(yī)藥、環(huán)境等)研究領域發(fā)揮重要作用。

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