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      應(yīng)用SSR分子標記方法檢測玉米種子真實性的幾點思考

      2013-11-29 00:52:00李巧英
      種子科技 2013年12期
      關(guān)鍵詞:雙帶單粒玉米種子

      李巧英

      (山西省農(nóng)業(yè)種子總站,山西 太原 030006)

      玉米是我國的第一大糧食作物,每年全國種植面積達3 333.3萬hm2,需種量約11億kg,龐大的市場份額吸引了眾多的國內(nèi)外種子企業(yè)進軍玉米種子市場。市場上銷售的玉米種子的品種越來越多,假冒侵權(quán)案件頻發(fā),市場監(jiān)管難度進一步加大,用原來的蛋白檢測方法已不能將現(xiàn)有的品種完全區(qū)分開來,而田間鑒定又受自然條件和品種表現(xiàn)性狀的限制,鑒定周期較長。近年來,隨著分子標記方法研究的發(fā)展,SSR分子標記方法檢測玉米種子真實性已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。但是在實際應(yīng)用過程中,也存在許多問題,值得大家思考。下面就SSR分子標記方法檢測玉米種子真實性試驗中遇到的問題進行一些探討。

      1 檢測樣品的純度問題

      檢測樣品的純度直接影響真實性檢測結(jié)果的判定。如果檢測樣品采取混樣提取DNA,由于檢測樣品純度較低,檢測后會出現(xiàn)單雙帶和雙帶、三帶的現(xiàn)象,導(dǎo)致檢測樣品與標準樣品的譜帶不同,鑒定困難。遇到這種情況,我們需要進行樣品提純,一是將樣品進行單粒提取DNA,與標準樣品比較(如圖1)后,剔除雜粒,再與標準樣品比較,獲得該樣品的譜帶類型,這種方法工作量較大;二是先做樣品的蛋白質(zhì)電泳,確定樣品的純度值,達到一定要求后再進行真實性檢測,這樣可以大大減少工作量,方法比較簡單。

      (如上圖:檢測樣品出現(xiàn)3種帶型,雙帶:1;雙帶:3、5;單帶:2、4。標準樣品為雙帶,帶型一致,與 3、5 號檢測樣品的帶型一致,表明檢測樣品不純,將1、2、4號樣品剔除后繼續(xù)做其他引物。)

      (上圖中,檢測樣品1—5帶型一致,均為單帶。標準樣品6—10出現(xiàn)兩種帶型,6、8為單帶,與檢測樣品帶型一致,7、9、10為雙帶,比檢測樣品多1條較小的帶,無法確定標準樣品的帶型。)

      2 標準樣品的純度問題

      標準樣品的譜帶是鑒定樣品的依據(jù)。如果標準樣品的譜帶不一致,無法確定該樣品的真正譜帶類型,很容易造成錯誤判斷,導(dǎo)致結(jié)論偏差(如圖2)。因此,玉米種子真實性檢測中所使用的標準樣品必須滿足一定的要求,符合有關(guān)規(guī)定,且純度合格。

      3 DNA提取方法的問題

      現(xiàn)在各個實驗室采用的DNA提取方法很多,有CTAB法、SDS法等常規(guī)的方法,有改良后的方法,還有簡化的方法。不管是用哪種方法,只要提取出來的DNA質(zhì)量能夠滿足做SSR分子標記檢測就可以,而且試驗操作簡單,方法容易掌握,使用藥品試劑少,對環(huán)境的污染也減少。一些方法經(jīng)過進一步試驗驗證后值得提倡。

      4 混樣檢測和單粒檢測的問題

      玉米種子真實性檢測可以混樣提取DNA,也可以進行單粒檢測。單粒檢測工作量大,混樣檢測可以大大降低工作量。但是,如果樣品的純度比較低,混樣檢測后會出現(xiàn)與標準樣品不同的譜帶,還需要再進行單粒檢測,以除去樣品中的雜粒。實際操作中,可以將混樣檢測和單粒檢測配合使用,對純度較高的樣品采取混樣檢測,純度不高的樣品宜采用單粒檢測,去掉混入樣品中的雜粒后再混樣檢測,以減少工作量。

      5 引物檢測的問題

      SSR分子標記方法檢測玉米種子真實性,目前主要采用檢測40對引物,差異位點數(shù)≥2,判定檢測樣品與標準樣品不一致。但是,在實際操作中,如果一個檢測樣品經(jīng)檢測出現(xiàn)兩對引物譜帶類型與標準樣品不一致,是否還需要繼續(xù)檢測其他的引物;若檢測,再檢測多少對引物比較合適,這一問題還需要進一步試驗驗證。

      6 電泳方法的選擇

      PCR產(chǎn)物檢測方法可以選擇小板膠電泳、大板序列膠電泳和毛細管電泳。3種方法比較,毛細管電泳檢測精確度高、操作簡單、省時省力,但是儀器本身、儀器維護、熒光引物、使用耗材等費用較高;序列膠電泳檢測需要灌膠、電泳、染色、圖片保存等程序,費時、費力,雖然費用較低,能夠滿足檢測樣品與標準樣品之間的兩兩一致性比較,但是精確度較低,無法讀出精確的數(shù)據(jù)結(jié)果;小板膠電泳檢測灌膠、電泳、染色等程序相對簡單,但是精確度更低,有些距離較近的譜帶不能很好地分開。實際應(yīng)用中,需要根據(jù)實驗室條件具體考慮。

      7 各個實驗室間試驗結(jié)果的對接

      如果用毛細管電泳進行檢測,可以得出較精確的數(shù)據(jù)結(jié)果,但是不同型號的儀器,甚至是相同型號的儀器,在不同的實驗室都會出現(xiàn)一定的偏差,需要進行數(shù)據(jù)的矯正與整合,各個實驗室間得出的檢測結(jié)果才具有可比性。如果用大板序列膠檢測,因為在序列膠上無法準確地讀出檢測樣品的數(shù)據(jù),只能看到它的相對位置,估測它的大小,要獲得準確的數(shù)據(jù)結(jié)果,需要檢測樣品與一個參照值進行比較得出它的精確數(shù)據(jù),才能實現(xiàn)實驗室間數(shù)據(jù)的對接。

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