董曉寧，李文楊，劉 遠，高承芳，張曉佩，林碧芬

(福建省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013)

羊口瘡是由羊口瘡病毒(orf virus，OrfV)引起羊和人接觸性、嗜上皮性傳染病，通過直接或間接接觸傳染[1]。據(jù)報道該病發(fā)病率可達50%，造成了養(yǎng)羊業(yè)巨大經(jīng)濟損失[2]。由于OrfV與某些病原感染后的臨床癥狀非常相似，尤其存在繼發(fā)或混合感染時，更增加了臨床診斷難度。目前準確診斷OrfV的方法有電鏡檢查、病毒分離、血清學診斷、PCR等，前兩種方法費時且需昂貴的設備，血清學診斷往往存在交叉反應，PCR由于具有特異性好、敏感性高、檢測快捷方便等優(yōu)點，常用于該疾病的診斷[3]。

隨著福建省山羊飼養(yǎng)量的增加，亦有多處山羊或人感染羊口瘡病例的臨床報道，影響了福建省山羊業(yè)的健康發(fā)展[4-5]。由于福建省內(nèi)羊口瘡均為臨床診斷結果，且缺乏系統(tǒng)流行病學特征及病原調(diào)查，一方面導致了免疫防控的困難，另一方面，臨床診斷依賴臨床病癥的出現(xiàn)，準確性、時效性較差，增長了疾病防控的周期。本研究擬開展福建省全省范圍內(nèi)的羊口瘡的流行病學調(diào)查，并利用PCR方法進行疾病診斷，以期為福建省羊口瘡的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床流行病學調(diào)查及病樣采集

于2011年選取泉州、福州、寧德、三明、莆田等地市規(guī)模山羊飼養(yǎng)場16個開展羊口瘡臨床流行病學調(diào)查。在感染羊口瘡的養(yǎng)殖場內(nèi)觀察感染羊只的病變過程，并采集病料保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病料處理

剪下病變痂皮或齒齦根部糜爛組織50～100 mg，用TE浸洗后，研磨，收集勻漿1 mL，反復凍融3次后，8 000 r/min離心10 min，收集上清，-70 ℃保存?zhèn)溆?，同一場?nèi)病樣混合后進行PCR檢測。

1.3 病毒DNA提取

病毒DNA提取試劑盒均購自北京鼎國生物技術有限公司，根據(jù)說明書提取病毒基因組DNA。提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計

參考顏新敏等[3]報道設計引物，其中上游引物為：5-CGAACTTCCACCTCAACCACTCC-3；下游引物為：5-CCTTGACGATGTCGCCCTTCT-3。擴增羊口瘡病毒長為507 bp的特異性片段。引物由上海生工有限公司合成。

1.5 PCR反應體系、反應條件及產(chǎn)物檢測

PCR 擴增試劑均構自上海生工有限公司。PCR 擴增的反應體系為：體系總體積 25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL(含Mg2+)，10 mmol/LdNTP Mix 0.4 μL，上下游引物(12.5 μmol/L)各0.3 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA 模板(25 ng/μL)1 μL，滅菌去離子水20.3 μL。擴增條件：94 ℃變性4 min，35個循環(huán)擴增(94 ℃：50 s，56 ℃：40 s，72 ℃：30 s)，72 ℃延伸10 min，25 ℃ 1 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

2 結 果

2.1 羊口瘡的流行概況

各調(diào)查點的觀察與統(tǒng)計結果表明,該病在福建省內(nèi)的發(fā)病率為10%～20%，死亡率小于10%，多發(fā)生于3～6月齡羔羊，呈地方性流行，成年羊發(fā)病較少，多為散發(fā)。多發(fā)生于春、秋季節(jié)，無性別和品種差異。病毒生存能力強，在有該病存在的羊群，可多年連續(xù)發(fā)生。

2.2 羊口瘡病毒的PCR檢測結果

試驗共檢測樣品21份，其中病樣13份，健康羊只樣品8份，用PCR擴增病樣可得到預期的507 bp條帶，健康羊只則不出現(xiàn)任何條帶，與實際情況完全符合，見圖1。

圖1 臨床病料PCR擴增結果Fig. 1 The PCR result of different samples M.DL 2000標準Marker；1,2,4,5.不同場病羊擴增結果；3.健康羊只擴增結果

3 討 論

羊口瘡的特點是傳播快，發(fā)病率高，雖然致死率低，但嚴重影響感染羊只采食，顯著降低養(yǎng)羊生產(chǎn)效率的同時容易造成并發(fā)感染加重養(yǎng)殖損失。經(jīng)過對福建省各養(yǎng)羊場羊口瘡的臨床流行病學調(diào)查，表明羊口瘡在福建省的發(fā)病率為10%～20%，死亡率小于10%，低于其他養(yǎng)羊集中地區(qū)[2,6]，可能飼養(yǎng)品種、模式、規(guī)模的區(qū)別是導致這一差異的主要原因。

近年來，福建省各地羊口瘡病例的報道較多，但均為臨床診斷結果，缺乏對病原的認識。由于羊口瘡在發(fā)病初期的臨床癥狀與山羊痘存在一定的相似性，在血清學上又存在一定的交叉反應，一般的臨床診斷方法很難區(qū)分；另外，臨床診斷依賴臨床癥狀的出現(xiàn)，容易延誤最佳疾病控制時期[7]。PCR快速診斷方法能在較短的時間(4～5 h)內(nèi)完成整個檢測過程，且具有特異性強、敏感度高等特點，該方法的建立一方面從分子水平上確診了福建省羊口瘡疾病的病原，另一方面為該地區(qū)羊群有效的防治羊口瘡疾病提供科學依據(jù)。

參考文獻：

[1] 殷 震，劉景華.動物病毒學[M].北京：科學出版社，1997：977-980.

[2] Mazur C, Machado R D. Detection of contagious pustular dermatitis virus of goat in a severe out break[J]. Vet Rec, 1989, 125:419-420.

[3] 顏新敏，張 強，吳國華，等.雙重PCR快速鑒別羊痘病毒和羊口瘡病毒[J]. 中國人獸共患病學報，2008,24(10)：945-948.

[4] 陳龍星，李奕梓，陳新梓. 山羊傳染性膿皰病的診治[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技，2007(2)：38-39.

[5] 張家確，吳景央. 一起人畜共患羊傳染性膿皰病的調(diào)查[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2006,42(9)：53-54.

[6] 何水林，陳 杰，蔡玉書，等. 羊口瘡病毒的分離與鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科技，2002,3(9)：21-23.

[7] 向智龍，程振濤，卓建華，等. 羊口瘡病毒PCR檢測方法的建立與應用[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2010,38(7)：145-147.