趙憲林，昝林森，田萬(wàn)強(qiáng)，胡建宏，王韋華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，陜西 渭南 71400;3.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程系，陜西 楊凌 712100)

奶牛性別控制技術(shù)是目前家畜繁殖新技術(shù)之一，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行X、Y精子分離已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)階段[1]。與常規(guī)精液相比，性控精液在精子質(zhì)量及受精率方面還有不足之處[2-3]。在精液的冷凍-解凍過(guò)程中，精液的稀釋和體外處理等程序都會(huì)對(duì)精子造成一定的損傷，造成大量精子死亡并產(chǎn)生活性氧簇離子(ROS)，從而導(dǎo)致精漿中抗氧化酶類的活力降低，影響精液品質(zhì)。Aitken等[4]研究認(rèn)為，ROS對(duì)精子的活力有極大的損害作用。ROS存在于精漿中，主要來(lái)源于芳香族氨基酸所催化死亡精子發(fā)生的反應(yīng)[5]。Flaherty等[6]在對(duì)人類的精液研究認(rèn)為，ROS不但能降低精子的活力，而且能引起男性不育。在精液中含有多種抗氧化物酶，其主要功能是消除精液中過(guò)多的ROS，過(guò)多的ROS則可導(dǎo)致精子質(zhì)膜過(guò)氧化和DNA損傷，少量的ROS對(duì)于精子的獲能和頂體反應(yīng)是必須的[7]，因此精液精漿中的抗氧化物酶的活力大小與精子品質(zhì)和精子受精率有著密切的關(guān)系。雖然如此，關(guān)于性控精液品質(zhì)及常規(guī)精液抗氧化酶活性方面的研究對(duì)于奶牛性別控制非常重要，但性控精液精漿抗氧化酶類的變化研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究旨在探討荷斯坦公牛性控精液和常規(guī)精液在活力、頂體完整率及精漿中四種抗氧化物酶類(ROS,GR,CAT,GSH)的活力差異，為性控精液的生產(chǎn)提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

主要儀器：流式細(xì)胞分離儀(MOFO-SX)、程控冷凍儀(法國(guó)卡蘇公司)、三相差熒光顯微鏡(NIKON公司)、離心機(jī)5810R (Eppendorf AG)、恒溫?zé)嵫h(huán)水浴鍋(sotemp 3028H)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH-B11·500型)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(HG101-2型)，電子分析天平(BS124S AG型)，細(xì)管一體機(jī)(法國(guó)，DIGITCOOL-5300型)，比色密度測(cè)定儀(RS-232型)。

主要試劑：果糖(天津石科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心)，檸檬酸鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，甘油(天津市化學(xué)試劑三廠)，慶大霉素(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)，林肯霉素(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)，壯觀霉素(sigma)。

1.2 精液稀釋液的制備

100 mL稀釋液：2.9 %檸檬酸鈉37 mL，12 %蔗糖液36.2 mL，卵黃20 mL，甘油6 mL。

上述稀釋液用磁力攪拌器攪拌30 min 以上，4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜備用。在精液稀釋前加入慶大霉素1.3 mL，林肯霉素0.3 mL，壯觀霉素35 mg，磁力攪拌器攪拌10 min，再放入37.5 ℃水浴鍋中備用。

1.3 精液采集及分離

本次試驗(yàn)地點(diǎn)是黑龍江大慶市大慶田豐生物技術(shù)有限公司。本試驗(yàn)選擇年齡3～5歲，體質(zhì)健壯、繁殖性能良好的荷斯坦種公牛，采用假陰道法采精。精液采集后立即送至檢測(cè)室進(jìn)行活力鑒定，活力大于0.65、密度大于1.5×109mL-1、且無(wú)異常氣味及顏色正常的精液視為合格精液。鑒定合格精液送染色室進(jìn)行活體染色。染色后的精液樣品送至分離室，使用細(xì)胞流式儀進(jìn)行X、Y精子分離。

1.4 精液冷凍

分離后的精液先在4 ℃環(huán)境中平衡90 min，再在添加VC的稀釋液中平衡10 min，離心，加稀釋液至目標(biāo)濃度，然后用分裝機(jī)分裝，分裝好的精液放入4 ℃冰箱中平衡4 h。平衡后的稀釋精液，用分裝機(jī)吸入有標(biāo)識(shí)的塑料細(xì)管內(nèi)并封口,然后把細(xì)管均勻擺放在細(xì)管金屬架上，然后將擺放細(xì)管的金屬架放入程控冷凍儀中進(jìn)行程控降溫，當(dāng)溫度降到-140 ℃時(shí)，細(xì)管投入液氮保存。

1.5 精液的解凍

從液氮中迅速取出3支凍精細(xì)管，立即投入38.5 ℃的溫水中解凍30 s，用于相關(guān)指標(biāo)分析。

1.6 精子質(zhì)量及精漿中抗氧化物酶活力檢測(cè)

1.6.1 精子活力檢測(cè) 本次試驗(yàn)精子活力由肉眼觀察進(jìn)行測(cè)定[8]。

1.6.2 精子頂體完整率檢測(cè) 細(xì)管凍精解凍后，取細(xì)管中間的一滴精液于載玻片的左端，用另一張邊緣光滑的載玻片呈35°角自左端接觸液滴，拉向另一側(cè)，制成抹片。自然風(fēng)干5～10 min后，用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15 min，水洗干燥后，用姬姆薩染色90 min，自來(lái)水沖洗，干燥，顯微鏡下觀察300個(gè)精子，統(tǒng)計(jì)頂體完整的精子數(shù)。

1.6.3 精漿酶活力測(cè)定 采用南京建成生物技術(shù)公司生產(chǎn)的酶活力測(cè)定試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明的操作規(guī)程測(cè)定精漿超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH)四種酶活力。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)精液與性控精液活力和頂體完整率比較

凍融后精子活力及頂體完整率的高低與精子受精率直接相關(guān)[8]。由表1可以看出，性控精液的精子活力比常規(guī)精液低5.33 %，與常規(guī)精液精子活率比較差異顯著(P<0.05)。性控精液的頂體完整率高出常規(guī)精液10.96 %，達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01)。

表1 常規(guī)精液和性控精液活力和頂體完整率比較Table 1 Comparison of vitality and cone complete rate between normal semen and sexed semen

注:同行肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note:Different small letters in the same row mean significant difference between treatments(P<0.05)，the capital letter means extreme significant difference between treatments(P<0.01)．The same below.

2.2 常規(guī)精液與性控精液抗氧化物酶活力比較

凍融后的常規(guī)精液和性控精液精漿中抗氧化酶類的活力見(jiàn)表2。由表2可以看出，性控精液CAT值為0.73 U/mL，低于常規(guī)精液3.23 U/mL，與常規(guī)精液相比差異極顯著(P<0.01)。測(cè)定常規(guī)精液SOD值為1.27 U/mL，比性控精液高出0.70 U/mL，達(dá)到顯著差異(P<0.05)。常規(guī)精液GSH活力為117.51 U/mL，比性控精液高出41.73 U/mL，差異極顯著(P<0.01)。GR活力常規(guī)精液為75.59 U/mL，比性控精液高出61.26 U/mL，差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，凍融后常規(guī)精液在活率方面顯著高于性控精液，但在頂體完整率方面性控精液顯著高于常規(guī)精液。在精漿中的抗氧化物酶類活力方面，性控精液凍融后其精漿中四種抗氧化物酶的活力都顯著低于常規(guī)精液。

表2 常規(guī)精液與性控精液精漿抗氧化物酶活力比較Table 2 Comparison of seminal plasma antioxidant enzyme activity between traditional semen and sexed semen

3.1 性控精液對(duì)精子活率和頂體完整率的影響

性控精液雖然可以控制家畜性別，為生產(chǎn)者帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)效益，但是其受精率低一直是困擾其大面積推廣應(yīng)用的主要因素。性控精液凍后活率低是其受精率低的主要原因。造成性控精液活率低的原因可能是精子經(jīng)過(guò)復(fù)雜的程序處理，在進(jìn)入冷凍程序之前處理時(shí)間太長(zhǎng)，精子能量消耗較大，活力減弱。分離后活力弱的精子可能會(huì)在冷凍解凍過(guò)程中大量死亡，有效精子數(shù)減少，活率降低。頂體完整率和精子的受精率相關(guān)，頂體受損，導(dǎo)致頂體酶流失，使精子失去受精能力。但是本試驗(yàn)表明，性控精液中的頂體完整率高于常規(guī)精液，原因可能是在分離的時(shí)候，大量的死精子被分離掉，使得原精中頂體破損并死亡的精子被除去。

3.2 性控精液對(duì)精漿中抗氧化物酶活性的影響

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物酶[12]，能還原對(duì)精子有毒害作用的過(guò)氧化物成為無(wú)毒的羥基化合物，同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解，從而保護(hù)精子細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害。本次試驗(yàn)證明性控精液的精漿中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶極顯著常低于規(guī)精液差異，由此可以證明在性控精液的冷凍及解凍過(guò)程中，精液中存在較大量的ROS。在精漿中GR也能消除H2O2，GR在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的作用下，使H2O2還原成H2O。所以在冷凍精液中GR的活力的高低與精子的品質(zhì)也有很重要的關(guān)系。本試驗(yàn)表明在性控精液中GR值顯著低于常規(guī)精液，則表明性控精液中極的精漿酶GR的活力低于常規(guī)精液。

綜上所述，在性控精液的精漿中四種抗氧化物酶類活力都顯著低于常規(guī)精液四種酶活力，活力低的原因可能是冷凍前對(duì)精液處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致精漿酶的值下降。也有可能是在精子活體染色的過(guò)程中，染料對(duì)GR的活力造成抑制，或者是精液稀釋液中缺乏對(duì)精漿酶起有效保護(hù)的物質(zhì)。由此可以表明，性控精液中的四種抗氧化酶類的活力值的高低與性控精液的品質(zhì)有很大關(guān)系，可能是造成受精率低的重要原因。研究開(kāi)發(fā)性控精液高效稀釋液和冷凍保護(hù)劑，提高性控精液精子活力，保證精液抗氧化物酶活力是當(dāng)務(wù)之急。

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