袁紅花,王珍珍,陳仁金,胡安康,張騰業(yè),吳連連,冀德君,朱孝榮*
(1.徐州醫(yī)學(xué)院, 江蘇 徐州 221004;2.揚州大學(xué),江蘇 揚州 225009)
牛皮蠅蛆病是由牛皮蠅寄生于牦?;螯S牛體內(nèi)引起的一種家畜寄生蟲病,牛只感染后可使產(chǎn)奶量和產(chǎn)肉量降低,牛皮穿孔,給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。研究發(fā)現(xiàn),紋皮蠅和牛皮蠅幼蟲能在宿主組織中移行8個月,其分泌的四種絲氨酸蛋白酶―皮蠅素,起免疫抑制作用,以致宿主不能用免疫機能殺死蠅的幼蟲。皮蠅素A(Hydermin A,HA)是牛皮蠅一期幼蟲在宿主體內(nèi)游行時分泌的一種絲氨酸蛋白酶。皮蠅素A具有抗炎、抑制補體反應(yīng)等功能[1-2]。
據(jù)研究報道,HA調(diào)節(jié)宿主免疫功能有下列3種機制: HA抑制IL-10生成,從而抑制T-淋巴細胞增殖[3];裂解補體C3,中斷宿主補體反應(yīng)途徑[4];HA通過前列腺素途徑,過表達前列腺素E2,減少IL-2生成,抑制免疫排斥[5]。HA這些免疫調(diào)節(jié)功能,抑制了宿主對牛皮蠅幼蟲的排斥反應(yīng),保證了牛皮蠅幼蟲在宿主體內(nèi)成活。HA具有很好的免疫原性,以其作為免疫抗原,可使被免疫的動物產(chǎn)生對牛皮蠅幼蟲感染具有保護性的抗體。利用生物學(xué)信息預(yù)測HA蛋白的高級結(jié)構(gòu)及親水性,根據(jù)分析結(jié)果選取預(yù)測抗原性較高與已知蛋白同源性低的多肽片段,采用固相多肽合成法合成多肽,免疫家兔,制備HA的多克隆抗體。為進一步研究HA的分子功能提供了有用的工具。
新西蘭大白兔為徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng);完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購自購自Gibco BRL公司;載體蛋白交聯(lián)試劑盒購自Pharmacia Biotech公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑及BcA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司;HRP-IgG抗體購自Santa Cruz公司。
1.2.1 生物學(xué)分析及多肽的設(shè)計 登錄進入http:// www.nicbi.nlm.nih.gov,采用Blastn和Blastx程序,進行同源性和保守性分析。利用生物信息學(xué)DNAstar (Protean)軟件對HA的二級結(jié)構(gòu)、抗原性、親水性、疏水性、結(jié)合位點、氨基酸的帶電性及所選擇氨基酸偏堿性和偏酸性等理化性質(zhì)進行分析[6]。設(shè)計含13~16個氨基酸的目的多肽。
1.2.2 多肽的合成及載體的偶聯(lián) 多肽的合成和與載體蛋白-血藍素聯(lián)(KLH)接交由百奇生物有限公司完成,多肽的合成采用9-氟甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,F(xiàn)moc)固相合成法合成多肽片段,利用高效液相法(highper formance liquid chromatography,HPLC)進行純化,純化后的樣品再用質(zhì)譜分析,純度為91.2%。
1.2.3 抗HA多肽抗體的制備 以250 μg/次劑量的多肽-KLH偶聯(lián)物與等體積的完全弗氏佐劑混合,采用背部多點注射法。兩周后取多肽抗原原液加等體積的不完全弗氏佐劑進行免疫,連續(xù)免疫3~4次,每次免疫10 d左右,從兔耳靜脈采血測定抗體效價,符合要求時,動脈取血,分離血清,-20 ℃保存。
1.2.4 ELISA檢測多克隆抗體的效價 人工合成裸肽作為抗原,以2 μg/mL為最終濃度溶解于包被液中,對應(yīng)孔加入100 μL抗原,室溫孵育2 h或4 ℃過夜;抗血清稀釋比分別為1∶1 k、1∶4 k、1∶8 k。以1∶1 k、1∶4 k,稀釋的正常兔血清作為陰性對照,37 ℃孵育1~2 h或室溫孵育3 h;每孔中加100 μL二抗,室溫孵育1 h,倒空并拍干殘留液體,加滿洗滌液清洗,重復(fù)2~5次;每孔中加入100 μL底物,顯色30 min,酶標(biāo)儀讀取405~410 nm波長處的OD值。
1.2.5 Western blotting 分析抗血清和多克隆抗體的特異性 提取牛皮蠅一期幼蟲的蛋白,進行SDS-PAGE 電泳分離,加心法電轉(zhuǎn)至PVDF膜,半干轉(zhuǎn)40 mA,45 min,室溫封閉1~2 h。多克隆抗體的終濃度為4 μg/mL,陰性和陽性血清稀釋比為1∶1 500,4 ℃孵育過夜。HRP-標(biāo)記的羊抗兔的二抗采用1∶1 000稀釋,室溫孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光底物檢測。
對HA序列進行抗原表性生物學(xué)信息分析(圖1),采用Blastn和Blastx程序發(fā)現(xiàn)HA3段多肽序列具有良好的序列特異性,多肽序列如表1所示。
圖1 HA抗原性的生物學(xué)信息分析A.同源性;B.親水性;C.β-轉(zhuǎn)角;D.柔性區(qū)域;E.易近性Fig. 1 Analysis of antigenicity of HA biological informationA.Homology;B.Hydrophilic;C.β-corner;D.Flexible regions;E.Easy to be close
采用間接ELSIA方法,對三只兔子的血清進行免疫檢測,并取陰性兔子為對照。陽性血清分別稀釋為1∶1 k、1∶4 k和1∶8 k,陰性血清分別稀釋為:1∶1 k和1∶4 k。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1∶1 k的條件下,樣本A、B和C的兩個重復(fù)抗血清的OD值分別為3.481、3.459和3.424(表2)。對A和B的多克隆抗體進行RP-HPLC純化,并通過質(zhì)譜鑒定,結(jié)果最終濃度分別達到1.14 mg/mL、1.17 mg/mL和0.96 mg/mL。
表1 多肽序列及其評分Table 1 Peptide sequences and scores
表2 血清的ELISA結(jié)果Table 2 The results of serum ELISA
提取牛皮蠅一期幼蟲的總蛋白,分別加入一抗(2 μg/mL),陰性血清(1∶1 500)和陽性血清(1∶1 500)。結(jié)果顯示一抗與陽性血清在28 kD處均有目標(biāo)條帶,說明HA 抗體的特異性較強(圖2)。
圖2 三種抗體的western印跡驗證結(jié)果1,4,7分別為抗1、抗2、抗3;2,5,8分別為陰性血清;3,6,9分別為陽性血清Fig.2 Western blotting result of the three antibodies 1,4 and 7 are respectively antibody 1, 2 and 3; 2, 5 and 8 are negative serums, while 3, 6 and 9 are positive serums
HA 是一種功能性抗原基因,在特異性的免疫系統(tǒng)中參與免疫調(diào)節(jié)過程。研究發(fā)現(xiàn),HA能降解補體C3 ,抑制補體介導(dǎo)的細胞毒性,從而延遲移植排斥反應(yīng)[7-8]??贵w是研究蛋白必不可少的研究工具,根據(jù)氨基酸序列合成多肽并與載體偶聯(lián),免疫制備多肽抗體是一種比較快速的手段。利用生物信息學(xué)對HA的抗原性及其親水性分析提示該氨基酸具有較好的抗原性,并發(fā)現(xiàn)抗原表位主要分布在氨基酸的C端,101~116,161~173,37~50的三個區(qū)域。
通過RP-HPLC方法測定人工合成的多肽發(fā)現(xiàn),其純度達到91.2%,并通過質(zhì)譜鑒定分子量與預(yù)計的分子量吻合為28 kD。然后與KLH連接,免疫新西蘭大白兔,得到了HA的多肽抗體。采用ELISA和western blotting方法驗證了抗體的特異性。ELISA結(jié)果顯示制備的HA多肽抗體特異性識別多肽,且滴度較高。同時從牛皮蠅一期幼蟲中提取蛋白,對制備抗體、陰性血清和陽性血清進行western blotting檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備抗體和陽性血清分別在28 kD處有目的條帶,而陰性血清沒有目的條帶。
綜上所述,結(jié)果顯示制備的HA多克隆抗體具有與抗原結(jié)合的特異性,并運用ELISA和western blotting方法進行了驗證。這為進一步研究HA的分子功能及免疫調(diào)控機制提供了有用工具。
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