小鼠腦組織中組胺含量的HPLC-UV檢測

許 濤，陶 芳，方 浩，馬張慶，洪宗元

(皖南醫(yī)學(xué)院 定量藥理研究所，藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

組胺(histamine)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，組胺能神經(jīng)元胞體位于下丘腦結(jié)節(jié)乳頭核(tuberomammillary nucleus，TMN)［1－2］。組胺由組氨酸(histidine)在組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase)作用下脫羧生成，合成的組胺主要被組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(histamine-N-methyltransferase)代謝生成 t-甲基組胺(t-methylhistamine)而失活［3］。組胺作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種遞質(zhì)，在很多中樞活動中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如睡眠-覺醒、學(xué)習(xí)記憶、攝食以及體溫調(diào)節(jié)等［4－7］。檢測不同生理狀態(tài)下腦內(nèi)組胺含量的變化是研究組胺調(diào)節(jié)中樞活動的重要手段之一［8－10］。組胺含量的檢測主要采用高效液相色-譜柱前衍生熒光檢測法［11］和高效液相色譜-柱后衍生熒光檢測法［12］。但高效液相色譜-熒光檢測法在樣品前處理時(shí)操作繁瑣，且要有專門的反應(yīng)裝置，對儀器設(shè)備的要求較高，而高效液相色譜-紫外檢測法無需特殊反應(yīng)裝置，操作較簡單，對設(shè)備無特殊要求，因而應(yīng)用更加廣泛。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種測定小鼠腦組織中組胺含量的柱前衍生高效液相色譜-紫外檢測法，為檢測腦組織組胺含量提供更為簡單快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 動物 8只昆明種小鼠，雄性，10～12周齡，體質(zhì)量(22±2)g，分籠飼養(yǎng)，室溫(25±2)℃，濕度 ＜60%，在12 h/12 h明暗周期光控環(huán)境飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。動物可自由進(jìn)食、進(jìn)水，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.2 藥品、試劑及主要儀器 組胺標(biāo)準(zhǔn)品(日本和光制藥工業(yè)株式會社，批號 KLP3326，含量97%)。乙腈為色譜純，乙酸銨、高氯酸、碳酸氫鈉等為分析純，丹磺酰氯(上海生物工程有限公司，批號:LY0426B1012J，含量 95%)。

Agilent 1100高效液相色譜儀(配有G1312A二元泵，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器，自動進(jìn)樣器和HP Chemstation工作站);PRO 200電動勻漿器;CR22GⅡ高速低溫離心機(jī)。

1.3 色譜條件 流動相:乙腈∶乙酸銨(0.01 mol/L)=70∶30(v/v)，色譜柱:Agilent HC C18，流速:1.0 ml/min，檢測波長:254 nm，柱溫:30℃，進(jìn)樣量:20 μl。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化 精密稱取組胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、10 μg/ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl于試管內(nèi)，依次加入200 μl飽和碳酸氫鈉溶液和400 μl丹磺酰氯溶液(10 mg/ml)，渦旋混勻后，在室溫條件下避光反應(yīng)60 min。反應(yīng)完畢后，加入氨水-乙腈混合溶液100 μl，避光靜置 30 min，最后用乙腈定容至1.0 ml，在4℃ 條件下離心(8 000 r/min)10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.5 腦組織勻漿樣本的制備與衍生化 小鼠在乙醚麻醉下斷頭處死后，迅速開顱取出全腦，在冰臺上分離出皮層(cortex)、海馬(hippocampus)和下丘腦(hypothalamus)［13－14］，稱重，按 1∶10 體積比加入0.2 mol/L 高氯酸(含 100 μmol/L EDTA-2Na)，制備腦組織勻漿。勻漿于0～4℃ 環(huán)境中冷卻30 min后，在4℃ 條件下離心(15 000 r/min)10 min，分離上清液。取上清液 100 μl進(jìn)行衍生化，方法同上。

1.6 精密度與準(zhǔn)確度 于1 d內(nèi)在腦組織勻漿樣品中添加組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成添加濃度分別為0.2、2.0、10.0 μg/ml三種濃度的加標(biāo)樣品各 5 份，并在連續(xù)5 d內(nèi)分別配制上述濃度加標(biāo)樣品各1份，按1.4方法處理后進(jìn)樣檢測，按加入量與實(shí)測值計(jì)算準(zhǔn)確度，并計(jì)算日內(nèi)、日間精密度(RSD)。

1.7 回收率測定 配制 0.2、2.0、10.0 μg/ml三種濃度的加標(biāo)腦組織勻漿和組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液樣本，按1.4方法處理后進(jìn)樣檢測，以峰面積比計(jì)算回收率(n=5)。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為與回歸方程 圖1為按上述方法測得的組胺標(biāo)準(zhǔn)品、空白樣品及腦組織勻漿的色譜圖。由圖可見，基線噪音小，組胺分離完全，不受雜質(zhì)峰干擾，峰形良好，保留時(shí)間約為6.1 min。在該試驗(yàn)條件下，以組胺色譜峰面積(у)為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)組胺濃度(χ)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在 0.1～10 μg/ml濃度范圍內(nèi)，組胺峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為 у=7.809 χ －0.04(γ2=0.9993)，最低檢出限為 0.1 μg/ml。

圖1 組胺經(jīng)衍生后的高效液相-紫外檢測色譜圖A:組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品;B:空白樣品;C:腦組織勻漿樣品Fig 1 Histamine derivatives by HPLC-UVA:Histamine standard reagent;B:Blank sample;C:Homogenized brain sample

2.2 精密度與準(zhǔn)確度 按1.6方法測得低、中、高三個(gè)濃度平均的日內(nèi) RSD為2.34%、3.17%和1.19%，日間 RSD 為 4.13%、2.87% 和 2.10%;準(zhǔn)確度分別為 99.32%、102.74% 和 100.08%(n=5)。

2.3 回收率 按 1.6 方法測得 0.2、2.0、10.0 μg/ml三個(gè)濃度樣本的回收率分別為(78.25±3.84)%、(83.16 ± 4.23)% 和(85.17 ± 4.67)%(n=5)，重現(xiàn)性良好。

2.4 小鼠腦組織組胺含量 小鼠腦區(qū)中組胺含量各不相同 (F=33.79，P ＜0.01)，其中下丘腦含量最高，約 0.21 μg/g(每克腦組織含 0.21 微克組胺)，與皮層和海馬相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(海馬:q=9.355，P ＜ 0.01;皮層:q=10.654，P ＜0.01)。見圖 2。

圖2 經(jīng)高效液相-紫外檢測法測得的不同腦區(qū)內(nèi)的組胺含量分布圖Fig 2 Distribution of the histamine content in the brain regions of mice by HPLC-UVValues are expressed as(n=8);*P ＜ 0.01，vs cortex or hippocampus

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)［15－16］基礎(chǔ)上，經(jīng)過改進(jìn)，建立了一種檢測腦組織勻漿中組胺含量的高效液相色譜-柱前衍生紫外檢測方法，該方法操作簡便，檢測限高，保留時(shí)間短，重現(xiàn)性好，無需特殊設(shè)備和試劑，為測定組織勻漿中組胺含量的相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)方法。

由于組胺沒有發(fā)色基團(tuán)，不能直接進(jìn)行檢測，因此檢測前需要對其進(jìn)行衍生化，使其生成發(fā)色基團(tuán)，才能在紫外檢測器上有響應(yīng)。較常用的衍生化試劑是鄰苯二甲醛，但該試劑不易保存，且其衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)選用丹磺酰氯作為衍生試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)效果較好。

流動相是高效液相色譜檢測物質(zhì)濃度的重要條件之一，良好的流動相可以得到基線穩(wěn)定，峰形良好，檢測峰與雜質(zhì)峰分離完全。為此在文獻(xiàn)［15－16］基礎(chǔ)上，我們先采用體積比為 80∶20的乙腈:0.01 mol/L乙酸銨溶液為流動相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組胺易受勻漿中雜質(zhì)干擾，組胺峰與雜質(zhì)峰有重疊，分離不完全。于是改用體積比為70∶30比例的流動相再行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果組胺分離完全，峰形良好，信噪比低且不受雜質(zhì)干擾。

對腦組織勻漿樣品中添加不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，在0.2 ～10.0 μg/ml范圍內(nèi)，組胺的回收率穩(wěn)定在78.25% ～85.17% 之間，表明本方法重現(xiàn)性好。取加標(biāo)腦組織勻漿樣品衍生溶液分日內(nèi)和日間重復(fù)進(jìn)樣5次，在以上濃度范圍內(nèi)組胺的平均日內(nèi)RSD＜ 2.5%，日間RSD＜3.03%，準(zhǔn)確度在99.32% ～102.74% 之內(nèi)，表明該方法精密度和準(zhǔn)確度高，適合微量組胺的檢測。

組胺作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種遞質(zhì)，通過組胺受體(包括H1、H2、H3等亞型)在中樞活動中起著重要的調(diào)節(jié)作用。組胺由組胺神經(jīng)元分泌，組胺神經(jīng)元胞體集中分布于下丘腦后部的 TMN，神經(jīng)纖維投射至幾乎所有腦區(qū)［1－2］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠下丘腦中組胺含量較皮層和海馬為高，這與我們之前用 HPLC-熒光檢測法所得的結(jié)果一致［10，17］，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的 HPLC-柱前衍生紫外檢測方法是可靠的。

［1］HAAS HL，PANULA P.The role of histamine and the tuberomamillary nucleus in the nervous system ［J］.Nat Rev Neurosci，2003，4(2):121 －130.

［2］BROWN RE，STEVNES DR，HAAS HL.The physiology of brain histamine［J］.Prog Neurobiol，2001，63(6):637 －672.

［3］HAAS HL，SERRGREEVA OA，SELBACH O.Histamine in the nervous system［J］.Physiol Rev，2008，88(3):1183 －1241.

［4］劉天雅，洪宗元，曲衛(wèi)敏，等.中樞組胺能神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)睡眠-覺醒機(jī)制研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(3):247 －252.

［5］黃育文，余建，陳忠.中樞組胺對學(xué)習(xí)記憶的作用［J］.醫(yī)學(xué)與工程，2002，4(1):44 －46.

［6］沈?yàn)I，王建軍.中樞組胺能系統(tǒng)研究的新進(jìn)展［J］.中國神經(jīng)科學(xué)雜志，2002，18(1):417 －421.

［7］ONDERA K，YAMATODANI A，WATANABE T，et al.Neuropharmacology of the histaminergic neuron system in the brain and its relationship with behavioral disorders［J］.Prog Neurobiol，1994，42(6):685－702.

［8］HONG ZY，HUANG ZL，QU WM，et al.An adenosine A2A receptor agonist induces sleep by increasing GABA release in the tuberomammillary nucleus to inhibit histaminergic systems in rats［J］.J Neurochem，2005，92:1542 －1549.

［9］HONG ZY，HUANG ZL，QU WM，et al.Orexin A promotes histamine，but not norepinephrine or serotonin，release in frontal cortex of mice［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，26(2):155 －159.

［10］洪宗元.前列腺素DP受體缺乏對小鼠腦內(nèi)組胺含量的影響［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24(3):169 －172.

［11］YOSHINORI I，RYOZO O，NAOTO A，et al.A Highly Sensitive Assay for Histamine Using Ion-Pair HPLC Coupled with Postcolumn Fluorescent Derivatization:Its Application to Biological Specimens［J］.J Neurochem，1992，58(3):884 －889.

［12］黃新華，陳本美，梁紹先，等.高效液相色譜柱后衍生法測定豚鼠鼻粘膜中組胺［J］.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，25(3):294－296.

［13］GLOWINSKI J，LVERSEN LL.Regional studies of catecholamines in the rat brain［J］.J Neurochem，1966，13():655 －669.

［14］陶芳，馬張慶，洪宗元.腺苷在小鼠腦組織中的分布［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，31(1):1 －3.

［15］金高娃，蔡友瓊，于慧娟，等.柱前衍生高效液相色譜法測定魚罐頭中的組胺［J］.色譜，2010，28(11):1099 －1102.

［16］丁卓平，劉辰麒，陳迪，等.高效液相色譜法同時(shí)測定水產(chǎn)品中10 種生物胺的研究［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2006，25(4):59 －62.

［17］洪宗元.組胺H1受體缺乏改變小鼠腦內(nèi)組胺含量及晝夜節(jié)律［J］.安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，28(3):320 －323.