婁志偉,王 爽,李玲玲 ,張鵬宇,王文彪 ,和翀翼*
(1.寵愛一生寵物醫(yī)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所,黑龍江齊齊哈爾,161003;3.哈爾濱大江牧業(yè)科技有限公司,黑龍江哈爾濱 150038;4.天津艾森生物工程有限公司,天津靜??h天宇科技園5號(hào) 301609)
奶牛子宮內(nèi)膜炎(endometritis)是指炎癥僅局限于子宮內(nèi)膜的病理過程[1],是奶牛最常見的產(chǎn)科疾病之一,也是造成奶牛不孕的主要原因之一。其發(fā)病率極高,國外統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率平均為30%~40%,我國統(tǒng)計(jì)為 20%~50%[2、3]。引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生物有細(xì)菌、病毒、真菌、支原體等,但以細(xì)菌感染較為常見。我們對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜為主要致病菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),旨在為臨床選擇安全有效藥物提供理論依據(jù)與試驗(yàn)支持。
1.1 試驗(yàn)藥品與試劑 金銀花、黃連、黃柏等中藥購于天津市老百姓大藥房;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯及生化試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。
1.2 試驗(yàn)菌種 化膿鏈球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌分離鑒定于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)臨床教研室。
1.3 試驗(yàn)設(shè)備 DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信儀器有限公司);DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信儀器有限公司);BCN-1360B型生物潔凈工作臺(tái)(天津市生物潔凈儀器廠)
2.1 復(fù)方中藥的組方與制備 選取金銀花、連翹、黃連、黃柏、大青葉、蛇床子、苦參、益母草、甘草、川芎、五靈脂、當(dāng)歸十二味中藥進(jìn)行組方。試驗(yàn)I:金銀花、連翹、黃柏、蛇床子、益母草、川芎、當(dāng)歸、甘草適量組成。試驗(yàn)II:金銀花、連翹、黃連、大青葉、苦參、益母草、五靈脂、甘草適量組成。并對(duì)復(fù)方中藥進(jìn)行提取,濃縮至1g/ml,微孔濾膜過濾,流通蒸汽滅菌30min后備用。
2.2 菌液的制備 將分離鑒定出的病原菌種接種入THB肉湯或普通肉湯(鏈球菌接種于THB肉湯,其它接種于普通營養(yǎng)肉湯),37℃活化24h后,采用麥?zhǔn)媳葷岱?,用THB肉湯和普通肉湯將細(xì)菌縣液稀釋至濁度為106CFU/ml備用。
2.3 體外抑菌試驗(yàn)
2.3.1 試管二倍稀釋法 分別測(cè)定復(fù)方中藥對(duì)化膿鏈球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。取滅菌試管10支,編號(hào),于1~9管中各加入無菌肉湯培養(yǎng)基或THB肉湯2ml(鏈球菌接種于THB肉湯),然后于第1管中加入1g/ml的受試中藥提取液2ml,混勻后取出2ml加入第2管,依此類推,直至第8管中取出2ml棄去,第9管為空白對(duì)照,第10管為藥液對(duì)照。然后1~9管中加入供試菌液或混合菌液0.1ml,搖勻,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。以不發(fā)生渾濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)作為該藥物的MIC值。將所有清晰無菌生長(zhǎng)的試管營養(yǎng)液接種于營養(yǎng)平板或THB平板,培養(yǎng)24h,以菌落數(shù)不超過5個(gè)的最低藥物濃度作為該藥物的MBC值。根據(jù)MIC值和MBC值評(píng)價(jià)中藥的體外抗菌活性。
2.3.2 打孔法 取供試菌液0.8ml傾于普通瓊脂平板表面(鏈球菌需THB瓊脂平板),使其均勻平鋪于表面。棄去多余的菌液,置37℃干燥15min,打孔器打孔(直徑6mm)后,在酒精燈火焰上稍微烘烤后,每孔加滿藥液(不能溢出),37℃培養(yǎng)24h,觀察并記錄復(fù)方中藥對(duì)種種細(xì)菌抑菌圈直徑的大?。╩m),每種藥物作四個(gè)重復(fù)。
3.1 復(fù)方中藥對(duì)各種細(xì)菌的MIC和MBC試驗(yàn)結(jié)果
對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌進(jìn)行中藥試管二倍稀釋法試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見表1,由表1可知:試驗(yàn)I組對(duì)五種病原菌的抗菌活性較強(qiáng),MIC及MBC達(dá)到8~64mg/ml,試驗(yàn)II組對(duì)除金黃色葡萄球菌外的四種病原菌的抗菌活性也較強(qiáng),MIC及MBC達(dá)到16~64mg/ml。
3.2 復(fù)方中藥對(duì)各種細(xì)菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果
注:抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)按《中藥藥理學(xué)》標(biāo)準(zhǔn):抑菌直徑>20mm為極敏,15~19mm為高敏,10~14mm為中敏,10mm以下為低敏,-表示無作用。
對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌進(jìn)行中藥打孔法試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見表2,由表2可知:試驗(yàn)I組與試驗(yàn)II組對(duì)五種病原菌均有抑菌效果,均能達(dá)到中敏到高敏。
中獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為奶牛子宮內(nèi)膜炎屬于帶下癥的范疇,分析其原因一是由于飼喂失調(diào),勞役過度,損傷脾氣,使運(yùn)化失常,不能化水谷為精微,反聚而為濕,濕濁下注;或腎氣虧虛,以致腎失閉藏,帶脈失約,使津液滑脫而下;二是由于脾虛濕盛,反而侮肝,肝郁化火,致濕熱下注;三是由于外邪入侵,如配種及人工授精不潔,助產(chǎn)不衛(wèi)生,邪毒客于胞宮之內(nèi),與氣血相搏,因而發(fā)病,或產(chǎn)后惡露不盡,或胎衣殘留胞宮,致使瘀血停滯胞宮之內(nèi),瘀久化熱而致病。
表1 復(fù)方中藥對(duì)各種細(xì)菌的MIC和MBC試驗(yàn)結(jié)果(單位:mg/mL)
表2 復(fù)方中藥對(duì)各種細(xì)菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果 (單位:mm)
藥有個(gè)性之特長(zhǎng),方有合群之妙用。試驗(yàn)I以金銀花、連翹、黃柏抑菌殺菌為主藥,蛇床子、益母草溫腎助陽,兼具殺蟲之效為輔,佐以川芎、當(dāng)歸活血行氣,以甘草為使;試驗(yàn)II以金銀花、連翹、黃連抑菌殺菌為主藥,輔以益母草溫腎助陽,五靈脂化瘀止血、活血止痛,苦參、大青葉為佐,以甘草為使。藥物共奏抑菌殺菌、活血止痛、解毒消腫、祛腐生新之功效。
中藥對(duì)主要病原菌抑菌試驗(yàn)中選取試管二倍稀釋法與打孔法,對(duì)于抑菌作用較強(qiáng)的藥物用打孔法其效果可能被掩蓋,用試管二倍稀釋法比較精確,但有些中藥提取液本身色澤深、混濁度大,在試管內(nèi)培養(yǎng)后不易觀察,因此,本試驗(yàn)綜合兩種藥物的抑菌作用,試驗(yàn)結(jié)果基本一致。試管二倍稀釋法試驗(yàn)結(jié)果表明:試驗(yàn)I組對(duì)五種病原菌的抗菌活性較強(qiáng),MIC及MBC達(dá)到8~64mg/ml,試驗(yàn)II組對(duì)除金黃色葡萄球菌外的四種病原菌的抗菌活性也較強(qiáng),MIC及MBC達(dá)到16~64mg/ml。打孔法試驗(yàn)結(jié)果表明:試驗(yàn)I組對(duì)蠟樣芽孢桿菌為極敏效果,對(duì)大腸桿菌及乳房鏈球菌達(dá)高敏效果,對(duì)化膿鏈球菌及金黃色葡萄菌均為中敏效果;試驗(yàn)II組對(duì)五種致病菌均為中敏效果。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果,篩選試驗(yàn)I組進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
[1] 林 羲.家畜病理學(xué)(第三版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:184-185.
[2]趙紅瓊.新疆奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定及其治療中草藥的篩選.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文[D],2005,6.
[3]弓素梅.治療奶牛子宮內(nèi)膜炎中藥栓劑的研究[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文,2006.