利用rbcL-a序列模擬檢測(cè)小鼠食性

劉杰昌，王 瑩，黎建至，黃汗青，歐輝超

(暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣州510632)

對(duì)于研究野外動(dòng)物生活習(xí)性來說，了解其食性是很關(guān)鍵的一環(huán)。只有了解動(dòng)物的食性才能研究該動(dòng)物在食物鏈的地位、適應(yīng)環(huán)境的能力和了解環(huán)境中物種的變化等。并且可通過動(dòng)物的食性了解其營(yíng)養(yǎng)狀況，有利于珍稀物種的研究保護(hù)［1］。

研究動(dòng)物的食性有幾種方法，一種是直接觀察。但是如果要研究活動(dòng)范圍大的動(dòng)物［2］所耗費(fèi)的時(shí)間會(huì)很多。而且環(huán)境中的物種組成復(fù)雜也會(huì)增加檢測(cè)時(shí)的難度。第二種是通過動(dòng)物的腸道內(nèi)容物研究其食物組成［3］，這種方法廣泛應(yīng)用在野外，但不適用于瀕危動(dòng)物的研究，尤其在復(fù)雜的環(huán)境中相比直接觀察更有效率。還有一種方法是利用動(dòng)物的糞便研究食物組成，有時(shí)候?qū)τ谘芯空湎?dòng)物或者是分布稀疏的動(dòng)物來說，糞便的收集往往比腸道物收集來得容易，而且對(duì)動(dòng)物的干擾更小［4］。

利用糞便研究動(dòng)物食性的技術(shù)具有收集方便，對(duì)動(dòng)物干擾小等優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外有幾種慣用的以糞便為基礎(chǔ)的技術(shù)。例如利用顯微技術(shù)分辨出糞便中微植物組織，但是這種方法由于有時(shí)候因?yàn)榧S便中存在著比較多種的植物碎片導(dǎo)致了錯(cuò)認(rèn)和漏認(rèn)［5］，而且往往需要研究人員具備專業(yè)的植物形態(tài)學(xué)分類知識(shí)和掌握大量的植物種類特征。利用碳氮穩(wěn)定同位素檢測(cè)動(dòng)物食性在之前是一項(xiàng)比較流行的研究方法，雖然這項(xiàng)技術(shù)能夠定性定量檢測(cè)出動(dòng)物中的食物組成［6］，但如果要研究食性廣泛的動(dòng)物這項(xiàng)技術(shù)會(huì)有很大的限制［7］。

而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以DNA條形碼技術(shù)為基礎(chǔ)的研究逐漸成為一種非常有前景的方法，它利用一段DNA序列來作為檢測(cè)各物種的標(biāo)記［8］，物種［9］和環(huán)境樣本［10，11］都能通過 DNA 條形碼技術(shù)來確認(rèn)其分類學(xué)上的關(guān)系。理想的DNA條形碼應(yīng)該是一段標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定、盡量短但是又能表現(xiàn)出種間差異。但是到現(xiàn)在還沒有找到一條符合各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼，于是研究學(xué)者會(huì)根據(jù)研究的目的而對(duì)標(biāo)準(zhǔn)有所側(cè)重。例如分類學(xué)家會(huì)首先考慮DNA條形碼是否標(biāo)準(zhǔn)，包含足夠的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)信息。而生態(tài)學(xué)者會(huì)考慮DNA條形碼是否穩(wěn)定和容易從環(huán)境材料中擴(kuò)增降解的DNA。實(shí)驗(yàn)中所研究的rbcL-a序列是質(zhì)體編碼Rubisco大亞基，簡(jiǎn)稱 rbcL基因(ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase large subunit gene)的一部分，最早由Poinar提出并應(yīng)用于糞便中植物物種檢測(cè)。它全長(zhǎng)只有157 bp，具有從高度降解的環(huán)境樣本中擴(kuò)增出DNA序列段的能力［12］。本研究模擬野外樣本的檢測(cè)方法，利用rbcL-a序列檢測(cè)小白鼠糞便中的植物物種，初步探究rbcL-a序列應(yīng)用于小鼠糞便中植物物種檢測(cè)的效果。

1 材料與方法

1.1 模擬環(huán)境樣本的收集

小白鼠是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用到的材料，且小鼠對(duì)食物并沒有特殊的偏好和厭惡，正好用來作為本次實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。本研究從動(dòng)物房中買來16只小白鼠，分成2組，每組8只。由于小白鼠體型較小，要收集足夠?qū)嶒?yàn)的糞便的量需要大量的時(shí)間，而且為了使糞便都來自同一個(gè)時(shí)間段，本研究把每組8只小白鼠的糞便收集在一起。挑選6種植物(表1)對(duì)小白鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，考慮到小白鼠的體型較小，食量較少，本研究把6種植物分成2份。在前兩天的中午和晚上，按時(shí)定性定量喂給小白鼠第一組植物(花椰菜、小麥、生菜)，然后，為了防止食物跟糞便粘連，在第3 d的傍晚清理糞便并不再喂食。到第4 d的早上收集糞便，糞便用1.5 mL的離心管裝好，寫上日期，得到了A組和B組糞便樣本，樣本直接放到-20℃冰箱中保存直至DNA提取。喂食小白鼠第二組植物(白菜、玉米、胡蘿卜)并按照第一組的流程進(jìn)行，在飼養(yǎng)結(jié)束后得到了C組和D組糞便樣本。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的6種植物學(xué)名及分類Tab 1 Botanical names and classification of 6 plants used in the experiment

1.2 糞便DNA提取及擴(kuò)增

收集的4組糞便樣本，用液氮研磨成粉狀。利用OMEGA公司所提供的HP Plant DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行總量DNA提取，方法步驟遵循著說明書的指引。為了消除糞便中腐植酸、酚類化合物對(duì)后面試驗(yàn)的影響，在步驟中加入OMEGA公司的HTR Reagent去除糞便中的污染物。PCR反應(yīng)在50 μL的總量進(jìn)行:2 μL DNA 模板，2 mM MgCl2，0.05 mg BSA，250 μM dNTPs ，200 nM primer，1 U Taq酶和1×PCR buffer。PCR 反應(yīng)所用試劑為Takara公司產(chǎn)品。rbcL-a序列的正向引物:5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGT-'3，反向:5'-CTTCTTCAGGTGGAACTCCAG'-3。rbcL-a序列與PCR反應(yīng)條件參照Poinar［12］的研究。

1.3 PCR回收、克隆與測(cè)序

PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)進(jìn)行DNA回收，利用TaKaRa公司的pMD18-T Vector試劑盒進(jìn)行TA克隆連接。已連接的載體轉(zhuǎn)化到制備好的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選后，挑取單菌落制成菌液，送去上海生工生物工程有限公司使用ABI-PRISM3730測(cè)序儀進(jìn)行單向測(cè)序。

1.4 序列分析

測(cè)序得到的序列利用ClusterX［13］軟件進(jìn)行完全比對(duì)。由于A組和B組糞便中食物組成是一樣的，C組和D組同上，所以把它們兩兩結(jié)合起來比對(duì)。比對(duì)中出現(xiàn)3次或3次以上的序列稱為共有序列［14］，出現(xiàn)的共有序列會(huì)進(jìn)行下一步的物種分析。如果某一序列假設(shè)為A序列，在樣本中出現(xiàn)1～2次，并跟共有序列比對(duì)只出現(xiàn)1個(gè)堿基的差異，我們認(rèn)為這是共有序列在測(cè)序時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤產(chǎn)生A序列，不進(jìn)行下一步的物種分析。但是只出現(xiàn)1～2次，與共有序列比對(duì)有2個(gè)或2個(gè)以上的堿基差異的序列我們排除這是測(cè)序發(fā)生的錯(cuò)誤，并進(jìn)行下一步的物種分析。

所有得到的共有序列與達(dá)不到共有序列的條件，但也排除了測(cè)序錯(cuò)誤可能的序列的物種分析利用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)［15］，將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中植物序列進(jìn)行比對(duì)。在慣有的比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，要使序列與物種匹配，序列與物種序列的相似度要達(dá)到98%以上和100%的序列覆蓋率［16］。為了縮小篩選范圍，我們把相似度提高到99%以上。如果序列能夠跟兩個(gè)或者更多的物種匹配，則把序列分配到包含所有匹配的物種的更高分類單元上［14］。與序列匹配的物種中如果含有序列相似度達(dá)到100%的物種，則不考慮相似度為99%的物種。

為了鑒定到更精確的分類單元，我們提取實(shí)驗(yàn)中用到的6種植物DNA并進(jìn)行rbcL-a序列的PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物直接送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行TA克隆測(cè)序(每種植物都挑取10個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序)。所有從糞便樣本得到的序列都會(huì)與得到的6種植物rbcL-a序列進(jìn)行比對(duì)。如果序列與某種植物rbcL-a序列的相似度和序列覆蓋率都達(dá)到100%，則認(rèn)為該序列屬于此植物物種。

2 結(jié)果與分析

本研究從4組糞便中共得到130條序列(每組31～36條)，在物種分析中除了排除低于標(biāo)準(zhǔn)(覆蓋率100%與99%以上相似度)的序列，我們還發(fā)現(xiàn)了與序列相匹配的物種序列描述是位于線粒體中的編碼Rubisco大亞基假基因或者是線粒體基因。這種情況可能是因?yàn)橹参锞€粒體中也存在著rbcL基因，出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增了線粒體rbcL基因或者與rbcL基因相似的假基因的現(xiàn)象。凡是有與線粒體基因匹配的序列我們都認(rèn)為是引物擴(kuò)增了錯(cuò)誤序列并排除［17］。

在擴(kuò)增6種植物rbcL-a序列中我們得到了5種植物的PCR產(chǎn)物，但是并沒有發(fā)現(xiàn)玉米的PCR產(chǎn)物，這在C組、D組的序列比對(duì)中同樣沒有找到與玉米種屬關(guān)系相近的序列。5種植物的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到的序列與GenBank物種序列進(jìn)行比對(duì)，在排除了假基因序列與覆蓋率、相似度不符合本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的序列，得到了生菜、花椰菜、胡蘿卜和白菜物種的唯一序列。序列已提交到日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)DDBJ(DNA Data Bank of Japan)。編號(hào)為:AB711139-AB711142。小麥 PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到兩條序列，這兩條序列互相比對(duì)發(fā)現(xiàn)其相似度只有98%(覆蓋率100%)，與GenBank序列比對(duì)中其分類單元都?xì)w屬到禾本科。

各組糞便樣本得到的序列利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)所匹配的分類單位在表2中。序列所屬的分類單元大部分都?xì)w屬到科，其中D組出現(xiàn)了屬的分類單元。序列與測(cè)序得到5種植物rbcL-a序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)花椰菜、胡蘿卜和生菜物種的rbcL-a序列分別有序列與之相似度達(dá)到100%，這三條待分析序列分別對(duì)應(yīng)著表2中A、B、C、D組的十字花科、D組的傘形科和蕓薹屬。

表2 利用BLAST軟件檢測(cè)到的植物分類單位(括號(hào)為該分類單元序列與5種植物rbcL-a序列比對(duì)所匹配的植物物種)Tab 2 Plant taxa detected with BLAST program(plant species in the brackets were belonged to the taxa sequence which was matched to 5 plant species of rbcL-a sequences

有趣的是，A組與B組鑒定到十字花科的序列與C組、D組鑒定到十字花科的序列的相似度為100%(覆蓋率100%)，也就是說，C組與D組中也出現(xiàn)了花椰菜的序列?；ㄒ伺c白菜同屬十字花科蕓苔屬，兩植物物種測(cè)序得到的序列顯示花椰菜與白菜的rbcL-a序列只相差一個(gè)堿基，但是兩種植物在挑取單克隆測(cè)序得到的序列并沒有出現(xiàn)相互混雜的情況，也就排除了在生菜物種中擴(kuò)增出能與花椰菜物種匹配的序列的可能性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中植物分組的情況，C組與D組出現(xiàn)的十字花科序列有可能是其糞便中殘留有花椰菜碎屑，但這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)說明。

在A組與B組的序列中我們發(fā)現(xiàn)有序列能夠匹配到禾本科的分類單元，但是與得到的兩條小麥rbcL-a序列比對(duì)其覆蓋率與相似度并沒有達(dá)到實(shí)驗(yàn)中要求的標(biāo)準(zhǔn)。不能確定是否得到了正確的小麥rbcL-a序列。鑒于之前的實(shí)驗(yàn)我們并沒有得到玉米物種的PCR產(chǎn)物，我們認(rèn)為rbcL-a序列可能不適用于檢測(cè)禾本科物種。6種植物rbcL-a序列測(cè)序中雖然得到了生菜rbcL-a序列，但是樣本A組與B組的序列中我們并沒有發(fā)現(xiàn)與生菜科屬有關(guān)的序列。這可能是在飼養(yǎng)過程中小白鼠并沒有把生菜當(dāng)做食物(即使在清理籠子里的糞便時(shí)我們只發(fā)現(xiàn)了生菜的碎片)，只當(dāng)作磨牙用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用rbcL-a序列結(jié)合分子克隆對(duì)小白鼠糞便進(jìn)行物種檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、快捷等特點(diǎn)。測(cè)序得到的130條序列利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定出3科和1屬。與單獨(dú)擴(kuò)增測(cè)序得到的5種植物的rbcL-a序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有待分析序列與花椰菜、白菜和胡蘿卜物種rbcL-a序列的相似性達(dá)到100%(序列覆蓋率100%)，分別確定其為花椰菜、白菜和胡蘿卜物種的序列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用rbcL-a序列模擬檢測(cè)小鼠糞便中的6個(gè)植物物種大部分能夠鑒定到科甚至屬的分類單位。通常野外植食性動(dòng)物或者是雜食性動(dòng)物食物來源廣泛，如果所研究的野外動(dòng)物的食物來源不是太局限于某一個(gè)植物的科屬的話，利用rbcL-a序列應(yīng)用到野外動(dòng)物糞便中的植物物種檢測(cè)還是能夠取得很好的效果。

rbcL-a作為檢測(cè)野外樣本中的植物物種的條形碼工具還是具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。只有157 bp的長(zhǎng)度使它容易從環(huán)境樣本中擴(kuò)增出DNA序列。雖然它的進(jìn)化速率不是很高［18］，在實(shí)驗(yàn)中它難以區(qū)分科以下的分類單位。但是如果能夠建立一個(gè)所研究的當(dāng)?shù)刂参镂锓N的序列庫(kù)［19］與待分析序列進(jìn)行比對(duì)(類似本實(shí)驗(yàn)的研究方法)，則能夠使待分析序列匹配到一個(gè)更低的分類單元。

在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)糞便對(duì)樣本中的殘留植物DNA影響較大。相比于直接提取植物DNA擴(kuò)增得到的rbcL-a序列比較單一且穩(wěn)定，從糞便中提取并擴(kuò)增出來的序列具有很大的多樣性。除了擴(kuò)增出線粒體假基因(這種情況在擴(kuò)增6種植物rbcL-a序列段也同樣存在)以外，也出現(xiàn)了很多在GenBank中找不到相似物種的序列，或者是擴(kuò)增了質(zhì)體中的其它序列段。在C組的測(cè)序結(jié)果中，其大部分序列都由一種單一共有序列構(gòu)成，且這段序列在GenBank相似度比對(duì)中顯示的是植物質(zhì)體的trnL基因，這也是C組與D組重現(xiàn)性不好的原因。幸好在技術(shù)方面，高通量、大規(guī)模測(cè)序已逐漸成為一股新的力量推動(dòng)著DNA條形碼技術(shù)高速發(fā)展［20］，有利于彌補(bǔ)擴(kuò)增和測(cè)序錯(cuò)誤等缺點(diǎn)，也節(jié)省了大量的時(shí)間(重復(fù)挑取單克隆的效率不高)。而隨著利用植物DNA條形碼對(duì)野外樣本的物種研究的深入，還有很多DNA條形碼像rbcL-a一樣投入這方面的研究，例如p6 loop序列［16］。相信在不久的將來，研究者在利用植物DNA條形碼對(duì)野外樣本的研究會(huì)取得更加矚目的成果。

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