推拿對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠微管相關(guān)蛋白-2的影響

高玉峰,吳劍聰,于 躍,耿 楠,李小琴,于天源

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京100029)

周圍神經(jīng)損傷是臨床的多發(fā)病、常見病,神經(jīng)再生與修復(fù)速度緩慢造成的靶器官萎縮、功能障礙是臨床上面臨的難點(diǎn)。盡管周圍神經(jīng)損傷的治療有了明顯提高,但還沒有達(dá)到真正的形態(tài)和功能重建。應(yīng)用傳統(tǒng)的推拿療法治療周圍神經(jīng)損傷的療效已經(jīng)得到臨床證實(shí),然而推拿治療周圍神經(jīng)損傷機(jī)制尚未完全揭示清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型,從行為學(xué)和形態(tài)學(xué)角度,探討推拿治療周圍神經(jīng)損傷的作用機(jī)理,為臨床治療周圍神經(jīng)損傷提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠80只〔北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證編號(hào)SCXK(京)2012-0001〕,體質(zhì)量約(150±10)g。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動(dòng)物分組:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、模型對(duì)照組、推拿組,每組16只。

1.2 儀器及試劑 按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國(guó)發(fā)明專利號(hào)200710187403.1),病理石蠟包埋機(jī)(沈陽(yáng)市龍首電子儀器有限公司LS-100),石蠟切片機(jī)(北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司Finesse 325),顯微鏡(麥克奧迪BA400)等。微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)抗體(Anti-MAP-2 antibody),生產(chǎn)廠家Abcam,編號(hào)ab70218。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備 坐骨神經(jīng)夾持損傷模型[1]:先將大鼠用10%水合氯醛以0.35 mL/100g的劑量腹腔注射麻醉;然后俯臥位固定,手術(shù)區(qū)(右側(cè)臀股交界處)剪毛、常規(guī)消毒,用手術(shù)剪沿坐骨神經(jīng)走行方向剪開大約1 cm的皮膚切口,止血,用止血鉗鈍性分離肌肉層,暴露梨狀肌下緣及坐骨神經(jīng);用彎鉤鑷確認(rèn)所暴露的組織確為坐骨神經(jīng)后,用小號(hào)持針器在距梨狀肌下緣5 mm處滿扣夾持坐骨神經(jīng)5 s,然后逐層縫合、碘伏消毒。假手術(shù)組,預(yù)處理及顯露坐骨神經(jīng)的方法同造模方法,但不做夾持。除了正常組不造模外,其余各組操作同模型組。

2.2 干預(yù)方法 各組均在造模后第7天開始干預(yù)。推拿組使用手法模擬儀(按摩頭為直徑10 mm的圓形光滑接觸面)依次刺激束縛后大鼠右側(cè)殷門、承山、陽(yáng)陵泉穴;手法模擬為點(diǎn)法、撥法、揉法;刺激力量為4N。每穴每法1 min,總計(jì) 9 min。正常組、假手術(shù)組、模型組不作干預(yù);模型對(duì)照組大鼠每天束縛9 min。在治療10次和20次后進(jìn)行行為學(xué)及免疫組化學(xué)檢測(cè)。

2.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 行為學(xué)檢測(cè)[2-3]:按Rivlin法制傾斜板,由兩塊矩形的合金板通過鉸鏈于一端相連而成,一塊作底板,另一塊為移動(dòng)板,表面鋪約6 mm厚的橡膠墊;斜板從水平位置起繞軸旋轉(zhuǎn),斜面角度可以測(cè)出;在室溫,安靜狀態(tài)下,將大鼠頭向前,身體縱軸與斜板縱軸平行放置,角度從小到大漸增,直至大鼠停留5 s而不跌落的最大角度作斜板實(shí)驗(yàn)行為學(xué)評(píng)分,每只大鼠重復(fù)測(cè)量3次,取平均值。各組分別于治療10次和20次作斜板實(shí)驗(yàn)行為學(xué)評(píng)分。

免疫組化學(xué)檢測(cè):各組分別于治療10次和20次后,大鼠灌注固定,取患側(cè) L3～5脊髓,再注入4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋、切片,經(jīng)脫蠟、水化,抗原修復(fù),SABC法染色,脫水、透明、封片、鏡檢,觀察蛋白表達(dá),并用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件進(jìn)行積分光密度統(tǒng)計(jì)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組和模型對(duì)照組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分與正常組相比明顯降低(P<0.05),推拿組與模型組相比明顯升高(P<0.05),并在治療20次后推拿組與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表 1。

表1 推拿治療后斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=8) 度

表1 推拿治療后斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=8) 度

注:與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

組 別 斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分治療10次 治療20次正常組 52.59±3.39 53.02±3.24假手術(shù)組 51.63±2.32 52.70±3.55模型組 43.42±2.50# 45.24±2.91#模型對(duì)照組 44.06±3.51# 45.95±2.79#推拿組 47.50±3.22#△ 51.20±2.86△

2.2 免疫組化結(jié)果 經(jīng)Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行積分光密度檢測(cè),統(tǒng)計(jì)采用一維方差分析進(jìn)行組間比較,SNK法進(jìn)行兩兩比較。見表2。

如表2所示,模型組和模型對(duì)照組MAP-2積分光密度與正常組相比明顯升高(P<0.05),推拿組與模型組相比明顯升高(P<0.05),與正常組相比明顯升高(P<0.05)。

表2 推拿治療后免疫組化結(jié)果(±s,n=8)

表2 推拿治療后免疫組化結(jié)果(±s,n=8)

注:與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

組 別MAP-2積分光密度治療10次 治療20次正常組 9.65±0.84 9.35±0.95假手術(shù)組 9.93±0.79 9.81±0.96模型組 12.08±0.90# 12.18±1.03#模型對(duì)照組 12.15±0.81# 12.31±0.92#推拿組 13.71±0.75#△ 13.96±0.87#△

4 討論

微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)的降解、丟失,使微管解聚,影響細(xì)胞骨架的完整性,使軸漿運(yùn)輸發(fā)生障礙,導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[4]。MAP-2參與神經(jīng)元發(fā)育、突起形成、突觸可塑性調(diào)節(jié),在神經(jīng)元軸突和樹突的發(fā)育、生長(zhǎng)、穩(wěn)定中起著重要作用[5]。許多神經(jīng)元去神經(jīng)后,其樹突內(nèi)MAP-2表達(dá)顯著減弱,而在創(chuàng)傷后突觸重建過程中,神經(jīng)元樹突內(nèi)的MAP-2表達(dá)顯著增強(qiáng)[6]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到,模型組的MAP-2表達(dá)高于正常組(P<0.05),提示大鼠坐骨神經(jīng)損傷后機(jī)體自然修復(fù)過程中可應(yīng)激性提高M(jìn)AP-2表達(dá)。假手術(shù)組與正常組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示坐骨神經(jīng)未損傷,則不會(huì)引起MAP-2的變化。模型對(duì)照組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明布袋束縛不會(huì)對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠MAP-2產(chǎn)生作用。推拿組與模型組比較MAP-2表達(dá)明顯升高(P<0.05),表明推拿干預(yù)下促進(jìn)機(jī)體MAP-2表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)元再生與修復(fù)過程;模型組的斜板實(shí)驗(yàn)行為學(xué)評(píng)分明顯低于正常組(P<0.05),說明神經(jīng)損傷后在自然修復(fù)過程中運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)緩慢。推拿治療組的斜板實(shí)驗(yàn)行為學(xué)評(píng)分高于模型組(P<0.05),并在治療20次后與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明推拿對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有較好的作用。這可能是通過促進(jìn)MAP-2在受損神經(jīng)相應(yīng)節(jié)段脊髓內(nèi)的表達(dá),從而提高微管的聚合能力,對(duì)神經(jīng)元胞體和突起的生長(zhǎng)產(chǎn)生積極的影響,促進(jìn)神經(jīng)元的存活,最終改善坐骨神經(jīng)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。

[1]于向民,周燕,潘曉亮,等.地塞米松對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷后脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CGRP的影響[J].中國(guó)康復(fù),2009,24(6):367-369.

[2]鄭慧敏,吳凡,于天源.周圍神經(jīng)損傷的行為學(xué)研究概況[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2009,37(2):167-169.

[3]張國(guó)平,張桓虎,張衛(wèi)東.三七總皂苷對(duì)脊髓損傷大鼠斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2012,50(1):9-10.

[4]錢軍,孫正義,馬延超,等.大鼠脊髓損傷后MAP-2的表達(dá)及與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的相關(guān)性[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,27(5):489-492.

[5]陳永剛,耿彬,王栓科,等.神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)大鼠脊髓損傷后微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的影響及意義[J].中國(guó)矯形外科雜志,2011,19(10):840-845.

[6]Oda Y,Iida Y,Kondo Y,et al.Wood cell-wall structure requires local 2D-microtubule disassembly by a novel plasma membraneanchored protein[J].Current Biology,2010,20(13):1197-1202.