郁盛雪，屈文慧，隋海娟，金迎新，金向楠，金 英

(遼寧醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室、2.2008級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生，遼寧 錦 州 121001)

神經(jīng)元樹突的功能是接收整合臨近神經(jīng)細(xì)胞的傳入信息，其長(zhǎng)度和分支可反映細(xì)胞的功能狀態(tài)，而許多營(yíng)養(yǎng)因子和應(yīng)激可影響樹突發(fā)育，進(jìn)而影響神經(jīng)環(huán)路的形成和功能［1］。樹突棘是樹突分支上的棘狀突起，是神經(jīng)元間形成突觸的主要部位，其形態(tài)變化與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)［2－3］。在一些退行性疾病中，如阿爾采末病(Alzheimer disease，AD)，其主要病理改變是神經(jīng)元，突觸的缺失以及突觸－軸突的病理性改變。因此，促進(jìn)神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)的藥物可能對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療和預(yù)防有著重要的意義。突觸蛋白(synapsins)是一組與突觸相關(guān)的具有神經(jīng)元特異性的磷酸蛋白，它作為突觸的特異性標(biāo)志物用于AD的研究，突觸素(SYP)是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質(zhì)，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸連接的形成和維持。突觸后致密蛋白95(PSD-95)是位于谷氨酸能突觸PSD中的一種膜相關(guān)蛋白，可通過(guò)不同結(jié)構(gòu)域與其它蛋白相互作用，串集NMDA受體及其信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白，組成受體-信號(hào)分子靶分子復(fù)合物，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用［4］。兩者作為突觸的特異性標(biāo)志物，是突觸核心構(gòu)建蛋白，在維持突觸正常功能和可塑性方面具有重要作用。他汀類藥物屬羥甲戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylgutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，是已知作用最強(qiáng)的降膽固醇藥物。阿托伐他汀(Ato)屬于他汀類藥物，現(xiàn)廣泛用于臨床，并呈現(xiàn)出生物效應(yīng)的多效性，包括抗氧化、抗炎癥、抗血小板聚集、抗腫瘤生長(zhǎng)、改善內(nèi)皮細(xì)胞等。目前，有很多證據(jù)顯示他汀類藥物有不依賴于其降脂作用的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用［5－8］?，F(xiàn)已有研究證實(shí)進(jìn)展性腦梗死早期應(yīng)用Ato可縮短腦梗死損害加重的達(dá)峰時(shí)間，可改善預(yù)后，具有神經(jīng)保護(hù)作用。一些在體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)Ato可以減少神經(jīng)元凋亡［9－10］。而Ato對(duì)大腦皮層神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，國(guó)內(nèi)外報(bào)道罕見(jiàn)。本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞觀察Ato對(duì)正常皮層神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)及突觸相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 阿托伐他汀(#23922105，純度 ＞98%)購(gòu)于LKT公司，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解。DMEM、F12培養(yǎng)基購(gòu)于 Invitrogen 公司、DMSO、Hoechst 33258、胰蛋白酶(Trypsin，1 ∶250)、L-多聚賴氨酸(Poly-L-lysine，#P2636)均購(gòu)于Sigma公司;新生胎牛血清、馬血清購(gòu)于廣州蕊特生物科技有限公司;HEPES(#391338)購(gòu)于Calbiochem公司;阿糖胞苷購(gòu)于意大利S.P.A公司;鼠SYP單克隆抗體、兔PSD-95多克隆抗體、山羊抗兔、山羊抗鼠二抗、鼠抗微管相關(guān)蛋白-2(MAP2)單克隆抗體及NeuN多克隆抗體和GFAP抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)于Beyotime試劑公司;Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司。其他相關(guān)試劑均由遼寧醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取出生0～24 h Sprague-Dawley大鼠乳鼠［動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2003-0007，遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供］，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡消毒，無(wú)菌條件下取出大腦皮層，置于培養(yǎng)基中，剔除血管和軟腦膜，剪成1 mm3左右的小塊。加入0.125%胰蛋白酶37℃消化10 min。待細(xì)胞分散后，加入含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000×g離心10 min，用含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×108～1×109·L－1，接種在鋪有L-多聚賴氨酸24孔或6孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后加入含阿糖胞苷(終濃度為5 mg·L－1)的培養(yǎng)基，抑制非神經(jīng)細(xì)胞增殖。以后每2天換液1次，培養(yǎng)4 d后用于實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用NeuN抗體和GFAP抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，結(jié)果顯示神經(jīng)元培養(yǎng)純度在90%以上。

1.3 細(xì)胞分組及處理 本實(shí)驗(yàn)分為三部分:第一部分觀察不同濃度Ato處理組對(duì)樹突生長(zhǎng)的影響，細(xì)胞分為對(duì)照組，加入含等量0.1%DMSO培養(yǎng)基;Ato處理組，培養(yǎng)4 d 神經(jīng)元加入 Ato(0.1、1、5、10 μmol·L－1)作用48 h;第二部分觀察Ato處理不同時(shí)間組對(duì)樹突生長(zhǎng)的影響，細(xì)胞分為對(duì)照組，加入含等量0.1%DMSO培養(yǎng)基;Ato處理不同時(shí)間組，將Ato 5 μmol·L－1加入培養(yǎng)4 d 神經(jīng)元，分別作用12、24、48 h;第三部分檢測(cè)Ato不同濃度處理組(0.1、1、10 μmol·L－1)作用 48 h 對(duì) SYP、PSD-95 蛋白表達(dá)的影響;檢測(cè) Ato 1 μmol·L－1時(shí)處理不同時(shí)間組(12、24、48、96 h)對(duì) SYP、PSD-95 蛋白表達(dá)的影響。

1.4 神經(jīng)元樹突形態(tài)學(xué)觀察分析 體外培養(yǎng)神經(jīng)元用配置CCD和Tsview軟件的Olympus CKX41型倒置相差顯微鏡，結(jié)合MAP2免疫熒光染色，用10倍或20倍物鏡觀察以確保將1個(gè)神經(jīng)元拍攝到1個(gè)視野中，分析時(shí)采取了Ohara和Havton的命名法［11］:從胞體直接伸出的樹突分支為一級(jí)分支，用Image J軟件測(cè)量，隨機(jī)選取的1個(gè)神經(jīng)元TDBL，并計(jì)數(shù)這個(gè)神經(jīng)元PDN。計(jì)數(shù)樣本來(lái)自3個(gè)不同批次培養(yǎng)的神經(jīng)元，每批次選取10～15個(gè)細(xì)胞。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)采取雙盲方法進(jìn)行。

1.5 免疫熒光染色檢測(cè)SYP、PSD95表達(dá) 培養(yǎng)7 d的皮層神經(jīng)元，移去培養(yǎng)基，用冷的PBS漂洗3次;用新鮮配置的4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3次，每次10 min;0.3%Triton X-100作用30 min，PBS漂洗3次，每次10 min;室溫下3%山羊血清封閉30 min;加入MAP2、SYP、PSD-95抗體 (1∶100)4℃過(guò)夜，PBS漂洗后，加入異硫氰酸熒光素(FITC)或羅丹明(TRITC)標(biāo)記的二抗作用2 h，PBS漂洗后Hoechst 33258核復(fù)染10 min。熒光倒置顯微鏡下檢測(cè)MAP2、SYP、PSD-95表達(dá)。

1.6 Western blot檢測(cè) SYP、PSD95蛋白表達(dá)水平原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，經(jīng)各種藥物處理不同時(shí)間后，用冷的PBS沖洗，立即放入預(yù)冷的裂解緩沖液中(1%Triton，0.1%SDS，0.5%Deoxycholate，1 mmol·L－1EDTA，20 mmol·L－1Tris(pH 7.4)，150 mmol·L－1NaCl，10 mmol ·L－1NaF，1 mmol·L－1Na3VO4，0.1 mmol·L－1PMSF)，4℃ 超聲粉碎后，12 000×g離心30 min，取上清，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，將各組蛋白濃度調(diào)成一致。用10%～12%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，每個(gè)泳道蛋白上樣量為20 μg。為了準(zhǔn)確判斷目的蛋白帶的位置，一個(gè)泳道加See Blue Plus 2預(yù)染蛋白標(biāo)記物，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用TBS［10 mmol·L－1Tris(pH 8.0)，150 mmo·L－1NaCl］洗膜 3次，每次10 min。將膜放入一抗中(1∶1 000)，4℃過(guò)夜。TTBS沖洗后，將膜放入二抗(1∶1 000)中，室溫孵育1～2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min，將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余試劑，放置化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光。測(cè)定SYP、PSD-95。每個(gè)抗體測(cè)定時(shí)都進(jìn)行β-肌動(dòng)蛋白測(cè)定，以保證蛋白上樣量的一致性。利用Visionworks 6.3.3.圖像采集及分析軟件對(duì)蛋白帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Fig 1 Effect of atorvastatin on the growth of dendrite cultured cortical neurons in vitro

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對(duì)培養(yǎng)皮層神經(jīng)元樹突的影響應(yīng)用倒置相差顯微鏡和MAP2免疫熒光染色，觀察發(fā)現(xiàn)Ato處理組(Ato 5 μmol·L－1)可促進(jìn)皮層神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)(Fig 1);應(yīng)用Tsview軟件測(cè)量神經(jīng)元TDBL和PDN，結(jié)果Ato能促進(jìn)皮層神經(jīng)元TDBL、PDN增加(Fig 1)。

2.2 阿托伐他汀處理不同時(shí)間對(duì)皮層神經(jīng)元樹突的影響 根據(jù)不同濃度Ato處理組對(duì)樹突的影響，我們選用Ato的最佳濃度5 μmol·L－1加入培養(yǎng)4 d神經(jīng)元分別作用12、24、48 h，結(jié)果顯示，Ato作用24 h，就可使培養(yǎng)神經(jīng)元TDBL和PDN均明顯增加，Ato作用48h后TDBL、PDN進(jìn)一步增加 (Fig 2)，但Ato 12 h這種作用不明顯。

Fig 2 The quantitative analysis of the results of TDBL，PDN affected by atorvastatin at different time points in each group(n=30)

2.3 阿托伐他汀對(duì)皮層神經(jīng)元突觸素和突觸后致密蛋白95蛋白表達(dá)的影響 Fig 3結(jié)果顯示，正常對(duì)照組SYP、PSD-95呈特征性顆粒狀或點(diǎn)狀分布于胞體周圍和沿著神經(jīng)元突起分布，染色淺且熒光表達(dá)強(qiáng)度較暗(Fig 3A、C)。Ato(5 μmol·L－1)作用48 h可使SYP和PSD95表達(dá)量明顯增多，點(diǎn)狀小顆粒連成細(xì)絲，能映襯出突起分支的輪廓;熒光表達(dá)強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)(Fig 3B，D)，說(shuō)明Ato能上調(diào)皮層神經(jīng)元SYP、PSD-95蛋白表達(dá)水平。

Fig 3 Expression of SYP and PSD-95 affected by atorvastatin with immunofluorescence，green shows SYP，red shows PSD-95，blue shows Hoechst 33528 nuclear redyeing

Fig 4 Western blot結(jié)果進(jìn)一步證明了Ato(0.1、1、10 μmol·L－1)作用48 h 可明顯增加 SYP 蛋白表達(dá)水平(P＜0.01)，Ato 1 μmol·L－1作用最明顯。應(yīng)用Ato作用12 h就可使SYP蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，其作用進(jìn)一步增加。

Fig 5 Western blot結(jié)果進(jìn)一步證明了Ato(0.1、1、10 μmol·L－1)作用 48 h 可明顯增加 PSD-95 蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)，Ato 1 μmol·L－1作用最明顯。應(yīng)用Ato作用12 h就可使PSD-95蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，作用進(jìn)一步增加，應(yīng)用Ato作用48 h達(dá)到高峰。

Fig 4 Concentration-dependent effect of atorvastatin on synaptophysin(SYP)protein levels in rat cortical neurons by Western blot.B is semiquantitative result of A(±s，n=3)*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.

3 討論

神經(jīng)元樹突具有接受刺激并將沖動(dòng)傳入細(xì)胞體的功能。樹突表面可見(jiàn)許多棘狀突起，稱樹突棘，是神經(jīng)元間形成突觸的主要部位。樹突分支的增加可以提供更多的表面進(jìn)行突觸發(fā)生［11］，因此樹突的發(fā)育決定了神經(jīng)元接受到突觸的數(shù)目和方式，所以樹突生長(zhǎng)出現(xiàn)缺陷的結(jié)果是非常嚴(yán)重的，常常伴隨著一些神經(jīng)退行性疾病如AD。因此突起正常的生長(zhǎng)和分支對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)正常行使功能是很關(guān)鍵的。

大量研究顯示在神經(jīng)元?jiǎng)偡只鰳渫缓洼S突后，突觸蛋白基因表達(dá)合成包含突觸前和突觸后蛋白復(fù)合物的囊泡，此時(shí)當(dāng)軸突和樹突接觸就形成初步配對(duì)的暫時(shí)性突觸聯(lián)系，最終由突觸活動(dòng)決定這些突觸會(huì)穩(wěn)定存在還是消失。SYP和PSD-95作為突觸功能的分子標(biāo)志，分別代表了突觸前和突觸后的可塑性過(guò)程，在皮層可塑性中發(fā)揮作用。說(shuō)明突觸蛋白在反應(yīng)性的突觸發(fā)生過(guò)程中起重要作用并參與發(fā)育神經(jīng)元的突觸形成。早期研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)的突觸蛋白均有降低。Ho等［12］采用重排的方法篩選了人的6 794種候選基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)synapsin-Ⅱ基因在早期AD患者的皮質(zhì)中的表達(dá)減少，提示synapsin-Ⅱ的表達(dá)在AD的早期有一定的調(diào)節(jié)作用。另有研究表明AD患者腦中殘存的突觸終端，在Aβ聚集的同時(shí)伴有PSD-95的減少、突觸后結(jié)構(gòu)的改變［13］，這一改變可能與NMDA受體過(guò)度激活所引起的鈣超載有關(guān)［14］。

本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度、不同時(shí)間條件下，Ato促進(jìn)皮層神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)和SYP、PSD-95蛋白表達(dá)，結(jié)果表現(xiàn)為Ato劑量依賴性的增加TDBL、PDN?？筛幸饬x的是Ato并未劑量依賴性的增加SYP、PSD-95 表達(dá)，反而是當(dāng) Ato 1 μmol·L－1時(shí) SYP、PSD-95 表達(dá)達(dá)高峰，而 Ato 10 μmol·L－1增加 SYP、PSD-95 的效果不及 Ato 1 μmol·L－1，我們考慮為藥物濃度過(guò)大可能會(huì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生抑制作用。就本次研究發(fā)現(xiàn)而言，對(duì)于直接作用于神經(jīng)元的化學(xué)物質(zhì)，往往破壞神經(jīng)元內(nèi)在平衡機(jī)制，當(dāng)濃度過(guò)大時(shí)可能會(huì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生一種不良反應(yīng)或毒性，其深層機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

Fig 5 Concentration-dependent effect of atorvastatin on PSD-95 levels in rat cortical neurons by Western Blot.B is semiquantitative result of A(±s，n=3).*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group

［1］Cully M，You H，Levine A J，et al.Beyond PTEN mutations:the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumor genesis［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(3):184－92.

［2］Staal S P，Hartley J W，Rowe W P.Isolation of transforming marine leukemia viruses from mice with a high incidence of spontaneous lymphoma［J］.Proc Natal Acad Sci USA，1977，74(7):3065－7.

［3］Staal S P.Molecular cloning of the akt oncogene and its human homologues AKT1 and AKT2:amplification of AKT1 in a primary human gastric Aden carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84(14):5034－7.

［4］閔 嶸，秦 川，趙志煒，等.APP17肽對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(6):710－4.

［4］Min R，Qin C，Zhao Z W，et al.Effect of APP17 peptide on the expression of synaptic associated protein in amyloid precursor protein transgenic mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(6):710－4.

［5］Koseoglu S，Lu Z，Kumar C，et al.AKT1，AKT2 and AKT3-dependent cell survival is cell line-specific and knockdown of all three isoforms selectively induces apoptosis in 20 human tumor cell lines［J］.Cancer Biol Ther，2007，6(5):755－62.

［6］Lawlor M A，Alessi D R.PKB/Akt:a key mediator of cell proliferation，survival and insulin responses［J］.J Cell Sci，2001，114(Pt 16):2903－10.

［7］Heitman J，Movva N R，Hall M N.Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast［J］.Science，1991，253(5022):905－9.

［8］Wullschleqer S，Loewith R，Hall M N.TOR signaling in growth and metabolism［J］.Cell，2006，124(3):471－84.

［9］Zhou X，Tan M，Stone Hawthome V，et al.Activation of the Akt/mammalian target of rapamycin/4E-BP1 pathway by ErbB2 over expression predicts tumor progression in breast cancers［J］.Clin Cancer Res，2004，10(20):6779－88.

［10］Debnath J，Walker S J，Brugge J S.Akt activation disrupts mammary acinar architecture and enhances proliferation in an mTOR-dependent manner［J］.J Cell Biol，2003，163(2):315－26.

［11］Stroemer R P，kent T A，Hulsebosch C E.Neocortical neural sprouting.Synaptogensis，and behavioral recovery after neocortical infarction in rats［J］.Stroke，1995，26(11);2135－44.

［12］Ho L，Guo Y，Spielma L，et al.Altered expression of a-type bue not b–type synapsin isoform in the brain of patients at high risk for Alzheimer's disease asscssed by DNA microarray technique［J］.Neurosci Lett，2001，298(3):191－4.

［13］Gylys K H，F(xiàn)ein J A，Yang F，et al.Synaptic changes in Alzheimers disease increased amyloid-beta and gliosis in surviving terminals is accompanied by decreased PSD-95 fluorescence［J］.Am J Pathol，2004，165:1809－17.

［14］Kelly B L，F(xiàn)erreira A.beta-Amyloid-induced dynamin 1 degradation is mediated by N-methyl-D-aspartate receptors in hippocampus neurons［J］.J Biol Chem，2006，281:28079－89.