鄧祖躍，匡 榮，朱社敏，王 丹，康 樺，趙 嘉

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310004)

近年研究已證實(shí)白藜蘆醇(resresveratrol，Resv)具有抗腫瘤、抗氧化、抗心血管疾病等作用［1］。Resv抗氧化作用的研究主要集中在其對超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的影響，但Resv對其他抗氧化作用影響的研究較少，本次實(shí)驗(yàn)我們觀察了白藜蘆醇對L-Arg-NO途徑及HDL的抗氧化成分——對氧磷酶1(paraoxonase-1，PON1)的表達(dá)和活性影響，以便更深入了解白藜蘆醇的抗氧化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 白藜蘆醇購買于中美華東制藥有限公司(98%，HPLC)，實(shí)驗(yàn)時用二甲基亞楓(DMSO，Sigma)溶解后蒸餾水配制為所需的濃度，其中DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過2%。總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等檢測試劑盒［德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司］。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);PON1測定ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 儀器 日立7020全自動生化分析儀(日本，日立公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國，Bio-rad公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國，Molecular Devices公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康♂SD大鼠30只，清潔級，平均體質(zhì)量200～250 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司［動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005］。平衡飲食1周后隨機(jī)分組，①正常對照組:飼正常飼料，并灌胃給藥(intragastric administration，ig)給予0.9% 氯化鈉注射液(4 ml·kg－1·d－1)。②高脂飼料模型組:飼高脂飼料(high fat diet，HFD)，并 ig 給予 0.9% 氯化鈉注射液(4 ml·kg－1·d－1)。③高脂飼料白藜蘆醇組:飼高脂飼料，并ig給予白藜蘆醇(50 mg·kg－1·d－1)。常規(guī)飲水，連續(xù)給藥 45 d。

1.4 樣本采集 末次給藥后次日，大鼠乙醚麻醉后，心臟取血，制備血漿，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫蟾谓M織，立即投入液氮中保存。

1.5 生化指標(biāo)測定 全自動生化分析儀測定血漿TG、TC、LDL-C及HDL-C的含量。多功能酶標(biāo)儀測定血漿中MDA、NO 、PON1的含量及SOD、GSH-Px、eNOS的活性。

1.6 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測大鼠肝組織PON1 mRNA的表達(dá) RT-PCR按TRIzol試劑盒說明書抽提肝組織總 RNA，紫外測定 OD260/OD280的比值(在1.8～2.0之間)。然后按逆轉(zhuǎn)錄酶說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以合成好的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PON1:上游引物5'-TGCTGGCTCACAAGATTCAC-3'，下游引物5'-AGCAGCGACTGTCGTACCTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 287 bp。GADPH:上游引物5'-GCATGGCCTTCCGTGTTCC-3'，下游引物5'-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為337 bp。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性94℃ 3 min，變性94℃40 s、退火53℃ 60 s、延伸72℃ 60 s、循環(huán)32輪 后，72℃延伸5 min，4℃ 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，并應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的片段PON1帶的灰度與內(nèi)參照GAPDH帶的灰度之比表示PON1mRNA的表達(dá)水平。

1.7 血漿PON1活性測定 參照文獻(xiàn)［2］，在25℃下用270 nm分光光度儀測定的血漿PON1活性。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對大鼠血漿血脂含量的影響 與HFD組比較，白藜蘆醇組大鼠血漿TC及LDL-C含量均明顯下降，而HDL-C明顯升高(P＜0.01)(Tab 1)。

2.2 白藜蘆醇對高脂血癥大鼠血漿 NO、MDA含量及eNOS、SOD、GSH-Px活力的影響 與HFD組比較，白藜蘆醇使大鼠血漿SOD、GSH-Px及eNOS活力及NO含量均明顯升高(P＜0.01)，MDA含量降低(P＜0.01)(Tab 2)。

Tab 1 Effects of Resv on TG，TC，HDL-C and LDL-C in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

Tab 1 Effects of Resv on TG，TC，HDL-C and LDL-C in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HFD group

Group TG/mmol·L －1 TC/mmol·L －1 LDL-C/mmol·L －1 HDL-C/mmol·L －1 Control HFD HFD+LP 0.77 ±0.31 0.84 ±0.32 0.83 ±0.35 1.91 ±0.16 4.44 ±0.83＊＊2.94 ±0.24##2.64 ±0.29 6.24±0.48＊＊3.62 ±0.27##3.34 ±0.22 2.48 ±0.26＊＊3.42 ±0.23##

2.3 白藜蘆醇對大鼠血漿PON1的含量及活性、肝組織PON1 mRNA表達(dá)的影響 與HFD組比較，白藜蘆醇使血漿PON1含量升高、活性增加，肝臟 PON1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)(Tab 3)。

Tab 2 Effects of Resv on NO，MDA contents and the activities of eNOS、SOD and GSH-Px in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

Tab 2 Effects of Resv on NO，MDA contents and the activities of eNOS、SOD and GSH-Px in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HFD group

Group SOD/kU·L－1 GSH-Px/kU·L－1 MDA/μmol·L－1 NO/μmol·L－1 eNOS/kU·L －1 Control HFD HFD+LP 104.72 ±19.33 40.23 ±14.25＊＊82.98 ±25.31##431.30 ±65.02 356.76 ±67.12＊＊393.78 ±45.16##4.18 ±1.51 7.43 ±1.49＊＊4.47 ±1.24##38.74 ±5.34 31.54 ±5.40＊＊36.34 ±5.14##46.07 ±4.56 36.17 ±6.23＊＊45.31 ±7.28##

Tab 3 Effects of Resv on PON1 content，PON1 mRNA expression and its activity in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

Tab 3 Effects of Resv on PON1 content，PON1 mRNA expression and its activity in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HFD group

Group PON1contents/mg·L－1 PON1mRNA PON1 activity/μmol/min·L －1 Control HFD HFD+LP 1.27 ±0.14 0.54 ±0.06＊＊0.83 ±0.08##2.28 ±0.14 1.83 ±0.13＊＊2.43 ±0.14##54.87 ±10.91 28.78 ±10.49＊＊61.42 ±12.23##

3 討論

髙脂狀態(tài)下，血脂升高，自由基生成增加，大量的自由基能破壞機(jī)體的氧化系統(tǒng)平衡，導(dǎo)致脂蛋白發(fā)生氧化修飾，其中ox-LDL對內(nèi)皮細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，造成內(nèi)皮損傷。損傷的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體產(chǎn)生過多的過氧化物，這些過氧化物可減少eNOS的表達(dá)、抑制L-精氨酸/一氧化氮(LArg-NO)途徑，減少NO產(chǎn)生并使NO清除速度加快、生物學(xué)作用減低［3］。損傷的內(nèi)皮使血液中的單核細(xì)胞及氧化脂蛋白更容易進(jìn)入內(nèi)皮下層，形成泡沫細(xì)胞和致動脈粥樣硬化(AS)。本次實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇降低了高脂大鼠血漿TC及LDL-C含量，消除了血脂升高引起的自由基活化，減少了受攻擊的脂蛋白量，降低了致AS的啟動因素。同時具有多酚結(jié)構(gòu)的白藜蘆醇通過清除自由基，增加SOD及GSH-Px活力，降低MDA含量，增加了體內(nèi)抗氧化能力［4］。另外，白藜蘆醇降低了ox-LDL產(chǎn)生，保護(hù)了血管內(nèi)皮，保護(hù)并提高了eNOS活力，提高了NO產(chǎn)生，而NO可和其它游離自由基結(jié)合產(chǎn)生反應(yīng)，從而使體內(nèi)自由基數(shù)量大大減少。

HDL抗AS作用除了其膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)功能外，還具有抗氧化作用，而其抗氧化作用主要由 PON1主導(dǎo)，目前認(rèn)為PON1活性可能成為HDL-C抗AS保護(hù)作用的新的有效標(biāo)志物［5］。白藜蘆醇增加大鼠血漿HDL-C、PON1的含量及 肝組織PON1mRNA的表達(dá)，血漿PON1活性增高，說明白藜蘆醇可能通過增加HDL-C含量來增加PON1含量、同時上調(diào)PON1mRNA的表達(dá)及提高PON1的活性使HDL-C的抗氧化功能增強(qiáng)。

簡言之，白藜蘆醇通過降血脂，提高抗氧化酶系統(tǒng)，活化L-Arg-NO途徑，增加PON1的表達(dá)及活性提高機(jī)體的抗氧化能力，從而實(shí)現(xiàn)抗AS作用。

［1］Pervaiz S，Holme A L.Resveratrol:its biologic targets and functional activity［J］.Antioxid Redox Signal，2009，11(11):2851－97.

［2］Rozenberg O，Rosenblat M，Coleman R，et al.Paraoxonase(pon1)deficiency is associated with increased macrophageoxidative stress:studies in PON1 knock out mice［J］.Free Radic Biol Med，2003，34(6):774－84.

［3］Humar K，Hazelrigg S R.Oxidative injury due to chronic nitric oxide synthase inhibition in rat:effect of regular exercise on the heart［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1587(1):75－82.

［4］Pendurthi W R，Williams J T，Rao L V，et al.Resveratrol，a polyphenoliccompound found in wine.inhibits tissue factor expression in vascularcells:A possible mechanismfor the cardiovascular benefits associated with moderate consumption of wine［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19(2):419.

［5］Tomas M，Latorre G，Senti M，et al.The antioxidant function of high-density lipoproteins:a new paradigm in atherosclerosis［J］.Rev Esp Cardiol，2004，57(6):557－69.