痛風(fēng)寧顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié) PGE-2、IL-8 及 IκB-α、IKK-α 的影響

蘇友新，陳寶軍，趙富強(qiáng)，閆 虎，周必洪，張 慶，張子怡

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

本課題組前期研究［1-3］發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)寧顆粒具有較好的抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛等功效，對急、慢性痛風(fēng)療效顯著；并通過檢測急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜“TLR-ILR／NF-κB”通路中某些信號分子的表達(dá)情況， 已確定 IL-1R、MyD88、TLR-2、TLR-4 等與痛風(fēng)寧顆粒的消腫、鎮(zhèn)痛等作用關(guān)系密切［4-5］。為進(jìn)一步闡明痛風(fēng)寧顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠抗炎、鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選取該信號通路下游起關(guān)鍵作用的 IκB-α、IKK-α 及炎性因子 PGE-2、IL-8作為指標(biāo)進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 45只健康SPF級SD大鼠，均為雄性，體重（200±10）g，由上海 Slacsis lab animal有限公司提供［許可證號：SCXK（滬）2011-0015］，委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心代購并飼養(yǎng)。

1.2 試劑及藥物 微晶型尿酸鈉（美國Sigma公司，批號：108K5309）；大鼠 IL-8、PGE-2 的 ELISA 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號：1103182、1103251）；兔抗大鼠 IκB-α、IKK-α 多克隆抗體（英國 abcam 公司，編號：GR27736-1、GR38675-1）；羊抗兔SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，編號：SA1022）；DAB染色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：990799）；痛風(fēng)寧顆粒：每克含生藥3.2 g（福州辰星藥業(yè)有限公司提供，產(chǎn)品批號：101024）；痛風(fēng)定膠囊：每粒 0.4 g（成都中匯制藥有限公司，產(chǎn)品批號：100701）；塞來昔布膠囊：每粒200 mg（由輝瑞制藥有限公司進(jìn)口分包裝，分包裝批號：95800309）。

1.3 主要儀器 RM2135切片機(jī)（德國LEICA公司）；AHB-LB-1萬能研究顯微鏡（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)（美國 Beckman Coulter公司）；ELX808酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIOTEK）；Image pro plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）；超純水制備系統(tǒng)Milli-Q Advantage（美國密理博）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥品制備

1.4.1.1 尿酸鈉懸濁液的制備 用電子天平稱取微晶型尿酸鈉2.5 g，高溫高壓，取無菌生理鹽水定容至100 mL，混勻，制成2.5%的尿酸鈉懸濁液，保存于4℃冰箱，用前搖勻。

1.4.1.2 干預(yù)藥物的制備 成人每日痛風(fēng)寧顆粒用量27 g，痛風(fēng)定膠囊用量4.8 g，塞來昔布膠囊用量400 mg，按照人與大鼠藥量關(guān)系［6］換算得出大鼠每日以上 3 個藥物用量分別為 2.93、520、43.3 mg／kg。然后根據(jù)每只大鼠體重得出其具體用藥量，加入2 mL蒸餾水，混勻，制成混懸液。

1.4.2 動物的分組及造模 45只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、痛風(fēng)寧組、痛風(fēng)定組、塞來昔布組共5組，每組9只，稱重并編號；參照Coderre造模方法［7］，各組大鼠均以右膝關(guān)節(jié)為中心常規(guī)消毒，正常組大鼠以右膝關(guān)節(jié)外側(cè)膝眼進(jìn)針，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 mL生理鹽水，其余4組以同樣方法右膝關(guān)節(jié)每個關(guān)節(jié)注射0.2 mL配制好的2.5%尿酸鈉懸濁液。

1.4.3 用藥干預(yù) 造模1 h后，痛風(fēng)寧組、痛風(fēng)定組、塞來昔布組大鼠按照體重分別予以相應(yīng)藥物混懸液2 mL灌胃，正常對照組、模型對照組大鼠以2 mL生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃3 d。

1.4.4 標(biāo)本采集 末次灌胃1 h后，采用300 mg／kg劑量水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，以右膝關(guān)節(jié)為中心，常規(guī)備皮，碘伏消毒，戴無菌手套，然后切開右膝關(guān)節(jié)囊，用1 mL生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，收集沖洗液；切取關(guān)節(jié)囊，采用4%中性甲醛固定液處理固定。

1.4.5 關(guān)節(jié)液細(xì)胞因子PGE-2、IL-8含量的檢測采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測關(guān)節(jié)沖洗液中PGE－2、IL-8的含量。具體步驟按試劑盒說明操作。

1.4.6 關(guān)節(jié)滑膜組織中IκB-α、IKK-α表達(dá)的檢測采用免疫組化技術(shù)測定關(guān)節(jié)滑膜組織中IκB-α、IKK-α的含量。一抗稀釋200倍，設(shè)PBS替代一抗的空白陰性對照；采用Image Pro Plus 6系統(tǒng)分析免疫組化圖像：免疫組化陽性反應(yīng)為細(xì)胞胞漿內(nèi)呈棕黃色或深棕黃色，陰性反應(yīng)為胞漿內(nèi)未著色。每張切片隨機(jī)分析5個不重疊視野（×400），100細(xì)胞以上，檢測這5個隨機(jī)視野內(nèi)的陽性染色面積及積分光密度值，以5個視野所得的數(shù)據(jù)的平均值作為最后結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子PGE-2和IL-8含量的變化見表1。

表1 5組PGE-2和IL-8含量的比較（）pg／mL

表1 5組PGE-2和IL-8含量的比較（）pg／mL

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與痛風(fēng)寧組比較，3）P＜0.05；與痛風(fēng)定組比較，4）P＜0.05。

IL-8 14.01±3.40 52.81±4.311）20.96±3.081）2）30.02±4.061）2）3）21.61±3.311）2）4）組 別正常組模型組痛風(fēng)寧組痛風(fēng)定組塞來昔布組n99999 PGE-2 45.87±16.41 109.56±24.471）3）41.40±9.442）110.91±33.071）3）92.52±14.741）3）4）

正常組、痛風(fēng)寧組關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子PGE-2含量顯著低于其它3組（P＜0.05）；模型組與痛風(fēng)定組、塞來昔布組比較無顯著性差異。正常組關(guān)節(jié)液中IL-8顯著低于其它各組（P＜0.05），而模型組顯著高于其它各組（P＜0.05）；治療的3組比較，痛風(fēng)寧組低于痛風(fēng)定組（P＜0.05），痛風(fēng)寧組與塞來昔布組之間無顯著差異；痛風(fēng)寧組仍高于正常組（P＜0.05）。

2.2 關(guān)節(jié)滑膜組織中IKK-α及IκB-α表達(dá)的變化見表2。

表2 5組關(guān)節(jié)滑膜組織中IKK-α及IκB-α的平均光密度值比較（）IOD／單位面積

表2 5組關(guān)節(jié)滑膜組織中IKK-α及IκB-α的平均光密度值比較（）IOD／單位面積

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與痛風(fēng)寧組比較，3）P＜0.05；與痛風(fēng)定組比較，4）P＜0.05。

IκB-α 光密度值0.3731±0.0282 0.2563±0.01921）0.3150±0.01561）2）0.2870±0.02551）2）3）0.3125±0.02231）2）4）組 別正常組模型組痛風(fēng)寧組痛風(fēng)定組塞來昔布組n99999 IKK-α光密度值0.3360±0.0155 0.4051±0.01391）0.3541±0.01701）2）0.3817±0.01941）2）3）0.3538±0.01201）2）3）4）

正常組關(guān)節(jié)滑膜組織IKK-α平均光密度值顯著低于其它4組（P＜0.05），而模型組較其它組高（P＜0.05）；痛風(fēng)寧組和塞來昔布組較模型組及痛風(fēng)定組低（P＜0.05）。正常組關(guān)節(jié)滑膜組織中IκB-α平均光密度值顯著高于其它4組（P＜0.05），而模型組較其它組低（P＜0.05）；治療的3組比較，痛風(fēng)寧組顯著高于痛風(fēng)定組（P＜0.05），與塞來昔布組比較無顯著性差異。

3 討 論

在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生階段，由于尿酸鹽結(jié)晶的刺激，病變局部出現(xiàn)微小血管充血，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起血管內(nèi)壁通透性增加，炎性滲出增多，導(dǎo)致組織水腫，引發(fā)局部疼痛，伴隨著產(chǎn)生大量炎性因子如 PGE-2、IL-8 等［8-9］。PGE-2 的作用引起劇烈疼痛，IL-8可進(jìn)一步趨化中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等到炎癥局部，加劇炎癥反應(yīng)［8］，形成惡性循環(huán)，最終加重痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作。因此，病變關(guān)節(jié)液中PGE-2、IL-8等含量的變化可以在一定程度上反映急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥程度。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中伴隨著諸多信號通路的激活或抑制，“TLR-ILR／NF-κB”信號通路系統(tǒng)就是其中重要的一個?！癟LRILR／NF-κB” 信號通路的激活對 PGE-2、IL-8 等炎性因子的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用［10］。研究表明：尿酸鈉結(jié)晶（MSU）在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作時，可同時激活I(lǐng)L-1受體（IL-1R）和Toll受體（Toll-like receptors，TLRs）［11-12］，活化的 IL-1R 和 TLRs 通過與胞漿內(nèi)銜接蛋白MyD88結(jié)合而形成復(fù)合物，前者可募集結(jié)合IRAK（IL-1受體相關(guān)激酶）并使之活化；活化的IRAK與TRAF6（TNF受體相關(guān)因子）結(jié)合后，又活化 TAK1（TGF-β 活化的激酶）， 導(dǎo)致 IκB（inhibitor of κB）激酶級聯(lián)反應(yīng)，使轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 等激活。NF-κB 位于“TLR-ILR／NF-κB”信號通路下游的樞紐位置，作為一個重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其作用范圍廣，對該信號通路激活后的效應(yīng)調(diào)控有重要意義。活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如PGE-2、IL-8及急性反應(yīng)期蛋白誘導(dǎo)的效應(yīng)因子酶iNOS等基因的表達(dá)［10］。NF-κB激活過程的環(huán)節(jié)多，IKK-α和IκB-α是NF-κB活化過程中的2個關(guān)鍵影響因子。IKK-α可促使胞漿中與NF-κB結(jié)合成非活化狀態(tài)三聚體復(fù)合物的IκB-αSer32／36磷酸化及泛素化，使得后者易被26S蛋白酶小體降解從而暴露 NF-κB，引起 NF-κB 的激活［13］；而 IκB-α 可以抑制“TLR-ILR／NF-κB”信號通路 NF-κB 的活化。有研究證明：小鼠缺失IκB-α后出現(xiàn)各種免疫性疾病與 NF-κB 被過量激活相關(guān)［14］。故 IKK-α、IκB-α 的表達(dá)高低在一定程度上可以反映 “TLR-ILR／NF-κB”信號通路下游的活動狀態(tài)，對NF-κB的活化及PGE-2、IL-8的調(diào)控發(fā)揮了重要作用。

本實(shí)驗(yàn)觀察到痛風(fēng)寧顆粒能夠降低大鼠病變關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中PGE-2、IL-8的含量，降低病變關(guān)節(jié)滑膜組織IKK-α的表達(dá)，促進(jìn)IκB-α表達(dá)，與模型組及痛風(fēng)定組比較均有顯著差異（P＜0.05）。提示痛風(fēng)寧顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎、鎮(zhèn)痛作用可能與降低“TLR-ILR／NF-κB”信號通路下游關(guān)鍵信號分子IKK-α的表達(dá)，減少IκB-α的降解，進(jìn)而抑制IL-8、PGE-2的表達(dá)有關(guān)。

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