和曉韻，底 妍，張利東，劉 健，劉清珍，李偉彥，嵇 晴

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、維持中發(fā)揮著重要作用［1－2］，磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)抑制劑能提高膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷腺苷(cyclic AMP，cAMP)水平，抑制細(xì)胞活化，減少炎性因子的產(chǎn)生［3－4］。PDE4存在4 種亞型(PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D)［5］，四種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的分布、哪種亞型參與細(xì)胞內(nèi) cAMP的調(diào)節(jié)目前尚不清楚。本研究采用Western blot法觀察4種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞的分布情況;采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)分別特異性沉默相應(yīng)的PDE4亞型基因，觀察內(nèi)毒素刺激前后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 新生SD大鼠(出生1～2 d)由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。

1.2 材料 DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液、谷氨酰胺溶液、胎牛血清(Gibco，美國(guó));多聚賴氨酸、LPS(大腸桿菌011:B4)(Sigma，美國(guó));大鼠 cAMP試劑盒(R＆D Systems，美國(guó));Anti-PDE4A 抗體、Anti-PDE4B抗體和Anti-PDE4D抗體(Abcam，美國(guó));Anti-PDE4C抗體(Fabgennix，美國(guó));Anti-rabbit IgG，HRP-linked 抗體(Cell Signaling Technology，美國(guó))。

1.3 原代小膠質(zhì)細(xì)胞分離 采用Xue等［6］所述的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法，并略加改進(jìn)。新生SD大鼠無(wú)菌條件下開顱取腦并剔除腦膜、血管及海馬，取大腦皮層，預(yù)冷PBS緩沖液沖洗3遍后用1 ml槍頭吹打，離心(1 000 r·min－1，10 min)，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按每瓶2×1011·L－1濃度接種于多聚賴氨酸預(yù)先包被的75 cm2培養(yǎng)瓶(Corning，美國(guó))，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。d2換全液，后按細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每隔2～3 d半量換液。培養(yǎng)9～10 d，可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底層，上層散在大量形狀不規(guī)則，透亮的小膠質(zhì)細(xì)胞，密封瓶口，置于37℃恒溫水平搖床內(nèi)，以160 r·min－1振蕩4 h，收集培養(yǎng)液，離心(1 200 r·min－1，10 min)，沉淀細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，按5×105/孔 密度將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞黏附20 min，用PBS緩沖液清洗1次，最后加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育備用。

1.4PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D 蛋白表達(dá)水平測(cè)定 采用Western blot測(cè)定。細(xì)胞蛋白定量后，將總蛋白(50 μg)加入SDS上樣緩沖液，煮沸5 min使其變性，經(jīng)SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液(5%脫脂牛奶)室溫封閉 1 h，分別加入PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D 一抗(1 ∶1 000，Anti-PDE4A 抗體;1∶1 000，Anti-PDE4B 抗體;1 ∶300，Anti-PDE4C 抗體;1 ∶500，Anti-PDE4D 抗體)4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗5 min×6次，羊抗兔二抗(1∶1 000，Anti-rabbit IgG，HRP-linked 抗體)室溫孵育lh，TBST清洗5 min×6次，暗室內(nèi)加顯色底物顯色曝光，掃描。內(nèi)參為GAPDH(1∶1 000，anti-GADPH rabbit antibody，Cell Signaling Technology，美國(guó))。

1.5 siRNA的制備 由Invitrogen公司合成實(shí)驗(yàn)所需siRNA序列(Tab 1)，錯(cuò)配siRNA為Blockit Alexa Fluor Red Oligo，載體為 LipofectaminTMRNAiMAX，以上所有序列均由Invitrogen公司合成。

Tab 1 Sequence of PDE4A-siRNA，PDE4B-siRNA，PDE4C-siRNA and PDE4D-siRNA in the expreiment

1.6 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LPS組、單純載體組、錯(cuò)配 siRNA組、PDE4A-siRNA 組、PDE4B-siRNA 組、PDE4C-siRNA組和PDE4D-siRNA組。轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)基更換為不含血清的高糖培養(yǎng)基?？瞻讓?duì)照組和LPS組:細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染;單純載體組、錯(cuò)配 siRNA組、PDE4A-siRNA 組、PDE4B-siRNA 組、PDE4C-siRNA組和PDE4D-siRNA組分別給予LipofectaminTMRNAiMAX 1 μl，錯(cuò)配 siRNA、PDE4A siRNA、PDE4B siRNA、PDE4C siRNA 和 PDE4D siRNA 各 2 μl。轉(zhuǎn)染前所有siRNA分別與1 μl LipofectaminTMRNAiMAX在100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中混勻 (siRNA終濃度為20 nmol·L－1)，室溫放置15 min后逐滴加入細(xì)胞，每孔終體積為500 μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.7 PDE4A、PDE4B、PDE4C 和 PDE4D mRNA表達(dá)的測(cè)定 轉(zhuǎn)染48 h后，采用RT-PCR檢測(cè)PDE4A、PDE4B、PDE4C和 PDE4D mRNA的表達(dá)。按照RNA提取試劑盒［RNA isolation kit(Invitrogen)］的操作步驟進(jìn)行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA。RT-PCR體系總反應(yīng)量為20 μl，利用 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen，USA)試劑盒在實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀上按照程序進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR(95℃ 2 min 變性，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，分別計(jì)算各組 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA的表達(dá)水平。

Tab 2 Primer sequence in the experiment

1.8 細(xì)胞內(nèi)cAMP檢測(cè) 采用ELISA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞;(2)轉(zhuǎn)染48 h后，更換培養(yǎng)基，除空白對(duì)照組外其余各組加入含有LPS(100 μg·L－1)的無(wú)血清培養(yǎng)基500 μl/孔，刺激30 min后收集各組細(xì)胞。按照ELISA試劑盒指示測(cè)定cAMP含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示。PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D蛋白及mRNA表達(dá)水平，細(xì)胞內(nèi)cAMP表達(dá)水平均采用單因素方差分析，其后組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法分別檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)4種亞型蛋白表達(dá)水平。如Fig 1所示，小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)PDE4 4種亞型蛋白。

2.2 轉(zhuǎn)染后小膠質(zhì)細(xì)胞 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA表達(dá)的變化 采用RT-PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組的 PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D mRNA的表達(dá)，然后分別與空白對(duì)照組進(jìn)行比較。如Fig 2A所示，與空白對(duì)照組相比，PDE4A-siRNA組PDE4A mRNA表達(dá)量明顯下降，抑制率為(63.4±5.2)%(P＜0.05)，其他各組 PDE4A mRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異。PDE4B-siRNA組、PDE4C-siRNA組和PDE4D-siRNA組結(jié)果與PDE4A-siRNA組相似，抑制率分別為(65.3±6.4)%、(66.8±4.8)%、(72.5±7.0)%(Fig 2B、2C、2D，P ＜0.05)。

Fig 1 Protein expression of PDE4 subtypes in primary microglia assessed by Western blot Lane 1，2，3，4 represent four microglial cell samples.

2.3 LPS刺激前后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cAMP表達(dá)的變化 如Fig 3所示，LPS刺激前，與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量無(wú)明顯變化(P＞0.05)。加入LPS刺激30 min后，與空白對(duì)照組相比各組細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量均明顯增高(P＜0.05)，但與LPS組相比，僅PDE4B-siRNA+LPS組細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量明顯升高(P＜0.05)，其余各組細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

3 討論

活化的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在多種疾病中發(fā)揮重要作用。提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，LPS為體外實(shí)驗(yàn)中常用的小膠質(zhì)細(xì)胞活化劑。既往有研究表明非特異性PDE4抑制劑可緩解神經(jīng)病理性疼痛。因PDE4存在4種亞型，本研究采用Western blot法觀察4種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞的分布情況，并采用RNAi技術(shù)沉默相應(yīng)亞型的表達(dá)，觀察內(nèi)毒素刺激前后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cAMP變化。Western blot結(jié)果表明PDE4 4種亞型均在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

RNAi技術(shù)是利用雙鏈 RNA(double stranded RNA，dsRNA)高效、特異性阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，促使mRNA降解，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的過(guò)程［7］。本研究根據(jù)基因文庫(kù)，分別設(shè)計(jì)了大鼠PDE4 4種亞型特異的siRNA序列，并采用脂質(zhì)體包裹。RT-PCR結(jié)果顯示:PDE4A-siRNA、PDE4B-siRNA、PDE4C-siRNA及PDE4D-siRNA只能抑制相對(duì)應(yīng)亞型的mRNA表達(dá)，對(duì)其它亞型無(wú)效，證明實(shí)驗(yàn)選用的siRNA具有高效特異性。

Fig 2 Change of mRNA expression of PDE4A，PDE4B，PDE4C，PDE4D after transfection

Fig 3 Change of cAMP level before and after LPS stimulation

在測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的研究中，我們的結(jié)果表明無(wú)LPS刺激的靜息狀態(tài)下，抑制PDE4 4種亞型中的某一種并不能改變細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，可能是由于靜息狀態(tài)下4種亞型均參與cAMP的降解，單獨(dú)抑制某一種亞型不影響基礎(chǔ)cAMP水平。LPS刺激后，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平反應(yīng)性明顯增高，但與LPS組相比，僅PDE4B亞型抑制后cAMP明顯升高，而分別單獨(dú)抑制PDE4A，PDE4C和PDE4D 3種亞型后細(xì)胞內(nèi)cAMP與LPS組差異無(wú)顯著性，說(shuō)明LPS刺激對(duì)PDE4B亞型的影響遠(yuǎn)大于其它3種亞型，LPS刺激狀態(tài)下，PDE4B可能在cAMP降解過(guò)程中發(fā)揮主要作用。

cAMP是廣泛存在于多種細(xì)胞的第二信使，cAMP主要通過(guò)其下游蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、環(huán)核苷酸操控離子通道(cyclic nucleotide-gated ion channels，CNG)以及環(huán)腺苷酸直接活化的交換蛋白(exchange proteins directly activated by cAMP，Epac)3條途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞功能［8］。眾多的研究提示，激活小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cAMP通路能抑制絲裂原刺激的細(xì)胞活化，可能是通過(guò)PKA和Epac途徑［9－10］。

綜上所述，RNAi技術(shù)能有效抑制PDE4B 4種亞型mRNA的表達(dá)，在細(xì)胞功能上進(jìn)一步證實(shí)了PDE4B siRNA能有效增加LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。PDE4B將成為治療慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新靶點(diǎn)，至于在細(xì)胞水平及動(dòng)物水平上PDE4B siRNA是否能有效減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而達(dá)到治療慢性神經(jīng)系統(tǒng)性病變，還有待進(jìn)一步研究。

［1］ 劉 健，李偉彥.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)病理性疼痛［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2009，22(2):103－6.

［1］ Liu J，Li W Y.Glia and neuropathic pain ［J］.J Med Postgrad，2009，22(2):103－6.

［2］ 郭建榮，賈東林.膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與神經(jīng)病理性疼痛［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(10):1278－81.

［2］ Guo J R，Jia D L.Glial cell line-derived neurotrophic factor and neuropathic pain［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(10):1278－81.

［3］ Mika J，Osikowicz M，Rojewska E，et al.Differential activation of spinal microglial and astroglial cells in a mouse model of peripheral neuropathic pain.［J］.Eur J Pharmacol，2009，623(1-3):65 －72.

［4］ Zhang B，Yang L，Konishi Y，et al.Suppressive effects of phosphodiesterase type IV inhibitors on rat cultured microglial cells:comparison with other types of cAMP-elevating agents.［J］.Neuropharmacology，2002，42(2):262 －9.

［5］ Jin S L，Ding S，Lin S C.Phosphodiesterase 4 and its inhibitors in inflammatory diseases［J］.Chang Gung Med J，2012，35(3):197－210.

［6］ Xue Y，Wang Y.Tetrandrine suppresses lipopolysaccharide-induced microglial activation by inhibiting NF-κB pathway1［J］.Acta Pharmacol Sin，2008，29(2):245－51.

［7］ Wu F X，Bian J J，Miao X R，et al.Intrathecal siRNA against Toll-like receptor 4 reduces nociception in a rat model of neuropathic pain［J］.Int J Med Sci，2010，7(5):251 －9.

［8］ Omori K，Kotera J.Overview of PDEs and their regulation［J］.Circ Res，2007，100(3):309 －27.

［9］ Woo M，Jang P，Park J，et al.Selective modulation of lipopolysaccharide－stimulated cytokine expression and mitogen-activated protein kinase pathways by dibutyryl-cAMP in BV2 microglial cells［J］.Mol Brain Res，2003，113(1):86 －96.

［10］ Moon E Y，Oh S Y，Han G H，et al.Epac1-mediated Rap1 activation is not required for the production of nitric oxide in BV2，murine microglial cells［J］.J Neurosci Res，2005，81(1):38 －44.