李文超，王龍閣，王保偉，顧有方，陳會(huì)良

研究表明許多中藥中的多糖類成分具有多種藥理活性，如香菇多糖、靈芝多糖、豬苓多糖等具有抗腫瘤的作用，黃芪多糖和人參多糖等具有增強(qiáng)免疫的作用，因此，多糖的研究已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的重視。多糖通常是由D－葡萄糖，D－半乳糖，L－阿拉伯糖，L－鼠李糖等聚合而成，由于糖類在強(qiáng)無(wú)機(jī)酸中為特有的脫水反應(yīng)生成醛類，它們和各種酚類縮合產(chǎn)生特有的有色物質(zhì)，因此常用硫酸－苯酚法和硫酸－蒽酮法作為多糖的含量測(cè)定方法，但由于不同植物多糖含量等不同，所以在測(cè)定多糖含量時(shí)，要對(duì)該方法各指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，以適應(yīng)不同植物多糖測(cè)定的需要。

菊花為菊科多年生草本植物的頭狀花序。其味甘、性寒，歷來(lái)就是中醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛的大宗中藥材。具有清肝明目，清熱解毒，散風(fēng)降壓的功效，可防治感冒、菌痢、腸炎、便秘、冠心病、高血壓等多種疾?。?－3］，具有極高的藥用價(jià)值，又可廣泛用于保健茶飲。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)菊花研究多集中于菊花黃酮［4－5］、綠原酸［6］、揮發(fā)油［7］和微量元素［7］等有效成分的提取分離及應(yīng)用研究，而對(duì)菊花中多糖的研究卻較少，尤其是對(duì)菊花多糖含量的測(cè)定方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文擬研究蒽酮 － 硫酸法［4－7］測(cè)定菊花多糖含量時(shí)各因素對(duì)結(jié)果的影響，并對(duì)這些因素進(jìn)行優(yōu)化，為菊花多糖含量測(cè)定的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊花粗多糖，由本實(shí)驗(yàn)室提取后保存。葡萄糖(105℃恒溫烘干至恒重)、苯酚、濃硫酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:精密稱取105℃干燥至恒重的D－無(wú)水葡萄糖0.100 0 g置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度搖勻，即配得1 mg/mL的的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液備用。

標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制:精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 mL，置于 50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。即得 0、10、20、40、60、80和100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用液備用。

供試樣品溶液的配制:準(zhǔn)確稱取菊花粗多糖(0.01 g)放入250 mL三角瓶中加適量蒸餾水，然后在沸水浴上加熱溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶定容至刻度搖勻，即得供試樣品溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，DK－B600型恒溫水浴鍋(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司)，Uvmini1240紫外－可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津)。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別量取標(biāo)準(zhǔn)使用液(40μg/mL)、供試樣品溶液各1.0 mL，以標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法顯色后，用 Uv mini1240紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)于500～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)每隔4 nm掃描一次，以確定最佳測(cè)量波長(zhǎng)

1.3.2 顯色溫度的選擇

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液和供試樣品溶液1.0 mL于試管中，依次加入蒽酮1.0 mL、濃硫酸4.0 mL，搖勻，分別在40、60、80和100℃下加熱10 min，冰浴靜置40 min，然后按照1.3.1確定的波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，確定最佳顯色溫度。

1.3.3 顯色時(shí)間的選擇

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液和供試樣品溶液1.0 mL于試管中，依次加入蒽酮1.0 mL、濃硫酸4.0 mL，搖勻，在1.3.2 確定的溫度下分別加熱 0、5、10、15、20、25和30 min。取出冰浴靜置40 min，然后取出按照1.3.1確定的波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，確定最佳顯色時(shí)間。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確吸取1 mL 的10、20、40、60、80 和100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用液分別置于6個(gè)干燥的試管中，依據(jù)1.3.1 －1.3.3 確定的測(cè)定條件，測(cè)其吸光值。

1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)液(40μg/mL)1.0 mL各6份，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測(cè)定吸光度。

1.3.6 回收率實(shí)驗(yàn)［9］

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液(40μg/mL)0.50 mL于5個(gè)干燥的試管中，各加入同一樣液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，補(bǔ)水至 1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測(cè)定其吸光度。

1.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取標(biāo)準(zhǔn)使用液和供試樣品溶液各1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法每隔20 min測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

標(biāo)準(zhǔn)使用液與供試樣品溶液比色后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)500～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。標(biāo)準(zhǔn)使用液和供試樣品溶液在644 nm處均有最大吸收，所以選擇644 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 最佳測(cè)定波長(zhǎng)的確定

2.2 顯色溫度的選擇

表1 不同溫度下的吸光度

由表1可知，隨著反應(yīng)溫度的升高吸光度有先減少后增大的趨勢(shì)，分析沸點(diǎn)溫度時(shí)吸光度增大可能是顯色液由于長(zhǎng)時(shí)間高溫條件下水分蒸發(fā)使?jié)舛仍龃笏?。所以選擇條件溫和且吸光度較高的40℃作為最佳顯色溫度。

2.3 顯色時(shí)間的選擇

由圖2可知，加熱15 min后標(biāo)準(zhǔn)使用液和供試樣品溶液的吸光度趨于平緩，所以選擇15 min為最佳顯色時(shí)間。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以葡萄糖質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制吸光度－葡萄糖質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線，其線性回歸方程為 y=0.062x+0.025，相關(guān)系數(shù)r為0.988 3。結(jié)果表明，葡萄糖在0～100 μg/mL范圍內(nèi)其濃度與吸光度線性關(guān)系良好，符合要求，如圖3所示。

圖2 不同顯色時(shí)間吸光度的比較

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)使用液和供試樣品溶液重復(fù)測(cè)定6次的RSD值分別為1.422 4%和2.202 8%，表明儀器的精密度良好和操作較規(guī)范。

表2 精密度測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

由表3可知，該實(shí)驗(yàn)方法的平均回收率為88.95%，RSD為8.09%，表明該方法的回收率一般。

表3 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

由表4可知，標(biāo)準(zhǔn)使用液的RSD為0.629 2%，供試樣品溶液的RSD為1.667 4%，表明顯色液在120 min內(nèi)的穩(wěn)定性良好。但方法簡(jiǎn)單、快速，無(wú)需多糖純品和高級(jí)儀器，因而被廣泛采用［10］，目前在菊花多糖的含量測(cè)定報(bào)道較少，僅見(jiàn)用后者硫酸－苯酚法的報(bào)道，而蒽酮－硫酸法測(cè)定菊花多糖含量的報(bào)道尚未見(jiàn)到。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究首次對(duì)測(cè)定菊花多糖含量的蒽酮－硫酸法進(jìn)行了優(yōu)化，以確定最佳測(cè)定參數(shù)，結(jié)果顯示蒽酮－硫酸法測(cè)定菊花多糖含量的最佳測(cè)定波長(zhǎng)為644 nm，顯色的溫度為40℃、顯色時(shí)間定為15 min。粗多糖含量在10～100μg/mL之間與吸光度成很好的線性關(guān)系?；貧w方程y=0.062x+0.025，相關(guān)系數(shù) r為0.988 3。實(shí)驗(yàn)方法的平均回收率為88.95%，RSD為8.09%。顯色液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性好。

蒽酮－硫酸法在無(wú)對(duì)照品又不具備高效液相色譜儀的情況下，采用本法具有方法簡(jiǎn)單、易掌握、結(jié)果準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)生產(chǎn)上檢測(cè)多糖含量，具有實(shí)用價(jià)值。

3 小結(jié)與討論

多糖的檢測(cè)方法一般可分為二大類，一類是直接測(cè)定多糖本身，如高效液相色譜法和酶法。另一類是利用楊酸法、斐林法、硫酸－苯酚法、蒽酮－硫酸法等。前者測(cè)定方法準(zhǔn)確，有效成分清晰，但需昂貴的儀器、多糖純品和特定的酶，操作步驟繁瑣，在應(yīng)用中受到限制。后者雖然測(cè)定結(jié)果靈敏度有限，

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