豬肺炎支原體概述及疫苗研究進(jìn)展

黎先偉 編譯

一、豬肺炎支原體在養(yǎng)豬業(yè)中的現(xiàn)狀

呼吸系統(tǒng)疾病是影響豬只健康的最重要的問(wèn)題之一。豬地方性肺炎的主要病原是豬肺炎支原體，屬于一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病。豬肺炎支原體在全球養(yǎng)豬業(yè)的感染情況非常普遍，大約38%～100%不等，而且會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失(Thacker and Minion, 2010）。

豬肺炎支原體主要寄生于呼吸道的纖毛上皮細(xì)胞，破壞細(xì)胞，并誘發(fā)感染動(dòng)物出現(xiàn)繼發(fā)感染(Thacker and Minion, 2010）。 支 原體代謝的毒性產(chǎn)物，如過(guò)氧化氫和超氧自由基等也可造成上皮細(xì)胞的損傷（Razin et al.,1998）。雖然不同日齡的動(dòng)物對(duì)該病原體均易感，但是生長(zhǎng)育肥階段的動(dòng)物受影響的程度最高。不過(guò)，對(duì)于無(wú)抵抗力的畜群，本病可影響所有生長(zhǎng)階段的豬群，包括乳豬和繁育豬群(Sibila et al.,2007）。

豬肺炎支原體引起的感染可用多種不同的措施來(lái)進(jìn)行診斷。特征性的臨床癥狀和病理變化可作為豬肺炎支原體的初步診斷，但確診需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。雖然人們通常認(rèn)為豬肺炎支原體的培養(yǎng)是診斷本病的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但這種方法并不經(jīng)常使用(Sibila et al.,2009）。這主要是因?yàn)樵贔riis培養(yǎng)液中分離病原菌非常困難(Friis, 1975）。此外，其他不同支原體的存在可能會(huì)抑制豬肺炎支原體的生長(zhǎng)，這將使得它們的分離變得更加困難。因此，從一些疑似感染動(dòng)物中未能培養(yǎng)出病原菌并不能排除這些動(dòng)物未受病原菌的感染(Thacker, 2004）。另外，人們也會(huì)經(jīng)常進(jìn)行免疫熒光（IF）的檢測(cè)，而血清學(xué)方法常用于監(jiān)測(cè)畜群的健康狀況，但這并不適合于個(gè)體動(dòng)物的診斷(Sorensen et al.,1997）。PCR 檢 測(cè)是目前診斷豬肺炎支原體感染最靈敏的方法(Calsamiglia et al.,1999）。

豬肺炎支原體的防控應(yīng)著重于管理措施和欄舍條件的優(yōu)化(Maes et al.,2008），抗菌藥物的使用(Vicca et al.,2004）以及合適的疫苗接種。一些商用疫苗，包括豬肺炎支原體全細(xì)胞滅活佐劑苗等均可在全球范圍內(nèi)使用。這些疫苗已被證實(shí)可有效降低感染的臨床癥狀，但僅有少數(shù)可防止已有病變的發(fā)展(Haesebrouck et al.,2004）。

以下將講述豬肺炎支原體的病因，發(fā)病機(jī)理以及防控措施，而且特別將重點(diǎn)放在目前已提出的后基因組時(shí)代的疫苗接種策略。

二、病原學(xué)

支原體屬于柔膜細(xì)菌類(lèi)，體積微小，無(wú)細(xì)胞壁，因此從表型上來(lái)看與其他細(xì)菌有差異。雖然支原體和其他細(xì)菌之間存在著根本的區(qū)別，但是支原體在分子生物學(xué)方面與革蘭氏陽(yáng)性菌有著許多相似之處(Thacker and Minion, 2010）。支原體是最小的非寄生的自我復(fù)制的微生物。它們也有著最小的基因組（580～1 350 kb）和較高的A+T含量（約70%）。豬肺炎支原體屬于最有序的豬支原體( Liu et al.,2011, M inion et al.,2004 and Vasconcelos et al.,2005）。

由于其基因組較小，支原體只進(jìn)行有限的代謝活動(dòng)和生物合成 (Razin et al.,1998）。 而 生 物 合 成途徑的缺乏意味著它們需要從外界生長(zhǎng)環(huán)境中獲取氨基酸、嘌呤和嘧啶，以及合成細(xì)胞膜的成分(Thacker and Minion, 2010）。 此 外， 支原體在體外培養(yǎng)的要求甚高，而且大多種類(lèi)的支原體都從未進(jìn)行過(guò)培養(yǎng)(Razin et al.,1998）。豬肺炎支原體可在體外進(jìn)行培養(yǎng)，但需要在介質(zhì)中補(bǔ)充血清和在Friis培養(yǎng)液中生長(zhǎng)(Friis, 1975）。豬肺炎支原體的培養(yǎng)和分離相當(dāng)?shù)馁M(fèi)力、費(fèi)時(shí)，而且經(jīng)常會(huì)失敗，因此分離病原菌一般不用于常規(guī)的診斷。此外，這也經(jīng)常容易受到其他支原體的污染，如豬鼻支原體（常存在于豬的呼吸道）和豬絮狀支原體（一種非致病性的支原體，其形態(tài)、生長(zhǎng)和抗原性與豬肺炎支原體有相似之處）(Thacker and Minion, 2010）。

支原體的這種苛求的特性和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的遺傳系統(tǒng)尚未闡明，在很大程度上阻礙了我們了解其生物學(xué)特性。支原體物種已發(fā)生了變化，可通過(guò)改變其表面特性，以避免被宿主的免疫反應(yīng)所識(shí)別和清除 (Browning et al.,2011）。 以 往 的研究已表明，豬肺炎支原體的基因組具有一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組織，并暗示著可能存在一種未知的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制(Siqueira et al.,2011）。豬肺炎支原體可產(chǎn)生粘附素、調(diào)控素、攻擊素和阻抗素，這可對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)進(jìn)行粘附和調(diào)控(Muneta et al.,2008）。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體的表面抗原能被蛋白水解處理后易位穿過(guò)細(xì)胞膜( Bogema et al.,2011 an d Wilton et al.,2009）。豬肺炎支原體選擇性切割其分泌蛋白的能力，使得這種病原菌具有一種非凡的性能，即可改變其表面結(jié)構(gòu)。

分子生物學(xué)技術(shù)表明，豬肺炎支原體在基因組(Strait et al.,2008）和蛋白質(zhì)組水平(Calus et al.,2007）上具有一個(gè)很大的多樣性。Vicca et al.(2003）的研究結(jié)果顯示，豬肺炎支原體在致病性方面也存在差異。這些作者根據(jù)實(shí)驗(yàn)室攻毒試驗(yàn)獲得的結(jié)果，將分離株歸為低毒力株、中等毒力株和強(qiáng)毒力株。Villarreal et al.(2011）的結(jié)果表明，低毒力豬肺炎支原體的感染并沒(méi)有對(duì)后續(xù)強(qiáng)毒株的感染和發(fā)病起到預(yù)防作用。然而，這有必要進(jìn)一步調(diào)查研究不同毒株之間差異的臨床重要性。

三、發(fā)病機(jī)理

豬肺炎支原體是豬的特定病原體，只感染豬。它的發(fā)病機(jī)理，尤其是有可能的致病因素目前尚未完全清楚。豬肺炎支原體可通過(guò)水平傳播（如飛沫）經(jīng)呼吸道黏膜感染健康的動(dòng) 物 (Thacker and Minion, 2010）。一旦吸入機(jī)體，豬肺炎支原體必須克服黏膜纖毛的活動(dòng)梯和大量糖基化粘蛋白的橫向?qū)?。在定植期間，支原體利用表面的糖復(fù)合物和細(xì)胞外基質(zhì)成分為細(xì)菌粘附素合成誘餌。豬肺炎支原體粘附于呼吸道上皮細(xì)胞纖毛上，最初可能會(huì)引起纖毛停滯、纖毛受損，甚至有可能造成上皮細(xì)胞死亡 (Debey and Ross, 1994）。

在這種病原微生物的定植和感染中，粘附于呼吸道上皮細(xì)胞的病原體，長(zhǎng)期的炎癥反應(yīng)刺激，以及先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的抑制和調(diào)制被認(rèn)為是非常重要的步驟。結(jié)果導(dǎo)致，受感染的動(dòng)物更容易受到其他呼吸道病原體的感染。

病原體粘附于纖毛的確切方式尚未完全闡明。不過(guò)相關(guān)研究已明確了一些參與粘附過(guò)程的蛋白。豬肺炎支原體多動(dòng)能的粘附素屬于P97/P102家族，其中包括 Mhp182 (P102）、Mhp183 (P97）、Mhp 493 (P159）、Mhp 494 (P216）、Mhp 683 (P135）、Mhp 271、Mhp 107 和Mhp 108 (P116）。這些粘附素是在肉湯培養(yǎng)期間( Pinto et al.,2007a, Wilton et a l.,2009 and Zhang et al.,1995）和體內(nèi)感染豬試驗(yàn) (Adams et al.,2005）中所表達(dá)的。研究已證實(shí)，P97 (Zhang et al.,1995）、P216 (Wilton et al.,2009）、P102 (Seymour et al.,2012）、Mhp271 (Deutscher et al.,2012）、Mhp107 (Seymour et al.,2011） 和Mhp683 (Bogema et al.,2011）的片段結(jié)合于豬的纖毛上。

P97蛋白是豬肺炎支原體中被首個(gè)發(fā)現(xiàn)的粘附素。它可識(shí)別存在于呼吸道上皮細(xì)胞纖毛上的受體，常被認(rèn)為是一種致病因子(Zhang et al.,1995）。P97蛋白的C末端部分，命名為R1，主要負(fù)責(zé)纖毛的粘合，而這需要8個(gè)R1重復(fù)單元。由于重復(fù)的氨基酸加或減的變化有可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的改變，從而干擾免疫系統(tǒng)的識(shí)別(Minion et al.,2000）。不過(guò)，其他因素或額外的蛋白質(zhì)也可能需要堅(jiān)持。

P102蛋白與P97蛋白的部分操縱子相同，而且雖然它的表達(dá)可能與病原體結(jié)合于纖毛有關(guān)，但有研究表明其與毒力有關(guān)，因?yàn)樵诟腥具^(guò)程中，它會(huì)在體內(nèi)表達(dá)(Adams et al.,2005）。除了這些發(fā)現(xiàn)以外，P102及其旁系同源基因的作用尚未清楚闡明。Seymour et al.(2010）研究了豬肺炎支原體232株P(guān)102的旁系同源基因P116（一種廣泛的加工蛋白）的表面表達(dá)和酶加工現(xiàn)象。結(jié)果顯示，這種蛋白是一種多功能的毒力因素，涉及豬肺炎支原體疾病的過(guò)程。該作者還指出，P102是一種具有多功能結(jié)合能力的蛋白，能夠補(bǔ)充豬肺炎支原體表面的血纖維蛋白溶酶原和纖連蛋白，這意味著P102蛋白在毒力中發(fā)揮著重要的作用。

事實(shí)上，P102和P97均是具有多功能結(jié)合能力的蛋白，能夠補(bǔ)充豬肺炎支原體表面的血纖維蛋白溶酶原和纖連蛋白，表明這兩種蛋白在毒力中發(fā)揮著重要的作用。血纖維蛋白溶酶原和纖連蛋白結(jié)合于豬肺炎支原體的表面具有劑量依賴性和可飽和性(Deutscher et al.,2012, Seymour et al.,2011 and Seymour et al.,2012）， 而且這兩種蛋白，P102和P97也是病原體感染過(guò)程中重要的目標(biāo)。血纖維蛋白溶酶原在豬肺部的支氣管肺泡液中是可隨時(shí)獲得的，而豬肺炎支原體的表面受體，在哺乳動(dòng)物血纖維溶酶原催化劑促進(jìn)血纖維蛋白溶酶轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，與血纖維蛋白溶酶原相結(jié)合(Seymour et al.,2012）。結(jié)果，豬肺炎支原體定植于纖毛上皮細(xì)胞，可能隔離器細(xì)胞表面上的血纖維蛋白溶酶原，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶。這個(gè)過(guò)程可能會(huì)造成組織侵潤(rùn)和全身性感染(Bogema et al.,2012）。

雖然豬肺炎支原體主要是呼吸道的病原體，但研究發(fā)現(xiàn)其可從內(nèi)臟器官中分離到，這意味著病原體或許可通過(guò)淋巴或血液循環(huán)在體內(nèi)進(jìn) 行 傳 播 (Marois et al.,2007）。 人工感染和接觸的豬群可從肝臟、脾臟和腎臟組織中重新分離到病原(Marois et al.,2007），而且在這些相同組織中也能檢測(cè)到豬肺炎支原體的DNA (Woolley et al.,2012）。 然 而，這種病原在體內(nèi)的蔓延似乎是短暫的過(guò)程，可能不會(huì)涉及疾病的發(fā)展過(guò)程( Marois et al.,2007 and Woolley et al.,2012）。

相關(guān)研究已證實(shí)，豬肺炎支原體對(duì)免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，但這種調(diào)節(jié)的本質(zhì)尚未充分認(rèn)識(shí)。豬肺炎支原體刺激形成肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，這與肺部病變和淋巴組織增生有關(guān)(Rodriguez et al.,2004），意味著在病變的發(fā)展過(guò)程中有免疫反應(yīng)的參與。在一般情況下，支原體能夠逃避宿主的天然防御能力。眾所周知，一些病原菌能夠利用它們的遺傳機(jī)制來(lái)改變其表面抗原，從而避開(kāi)宿主的免疫應(yīng)答，形成慢性感染(Razin et al.,1998）。

3株豬肺炎支原體的測(cè)序與比較分析的數(shù)據(jù)，可對(duì)與致病性有關(guān)的菌株的特異性區(qū)域進(jìn)行鑒定(Minion e t al.,2004 and Vasconcelos et al.,200 5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株致病性的菌株均存在一個(gè)綜合接合因子（ICE）。這意味著，ICE是一個(gè)可移動(dòng)的DNA成分，可能與基因重組和致病性有關(guān)(Pinto et al.,2007b）。此外，一些研究已發(fā)現(xiàn)了豬肺炎支原體在感染過(guò)程中被免疫系統(tǒng)識(shí)別的蛋白質(zhì)(Chen e t al.,2008, Chen et al.,2003, Marchi oro et al.,2012 and Simionatto et al.,2012），這些蛋白可能具有重要的生理功能，和/或與發(fā)病機(jī)理有關(guān)。不過(guò)，這仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明這些抗原在感染過(guò)程中的作用，以及涉及這種病原發(fā)病的作用機(jī)制。

四、控制措施

豬肺炎支原體引起的感染可通過(guò)多種因素的相互結(jié)合來(lái)進(jìn)行綜合防控，如管理措施、生物安全措施和欄舍條件的優(yōu)化，以及抗生素和疫苗的使用。管理措施的改善是控制這種疾病的關(guān)鍵，而且這是檢測(cè)到豬肺炎支原體后首要采取的措施(Maes et al.,2008）。

抗生素（如四環(huán)素類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)）常用于治療呼吸系統(tǒng)疾病（如豬地方性肺炎〈Vicca et al.,2004〉）。由于病原菌是在呼吸道的表面上定植，因此唯有抗生素能夠在呼吸道的粘液和液體內(nèi)達(dá)到較高的濃度才能夠在體內(nèi)達(dá)到預(yù)期的效果。經(jīng)有效的抗生素處理過(guò)的豬群，其臨床癥狀和肺部病變較少，而且繼發(fā)感染的現(xiàn)象 也 會(huì) 降 低 (Ciprian et al.,2012）。盡管在控制豬肺炎支原體感染方面藥物治療方案是成功的，但往往只能實(shí)現(xiàn)局部性的保護(hù)。這種效果可能是不能持續(xù)的，因?yàn)楫?dāng)停止治療措施后，疾病又有可能會(huì)復(fù)發(fā)(Thacker and Minion, 2010）。此外，抗生素的預(yù)防或用藥措施應(yīng)盡可能最小程度地采用，以避免抗生素耐藥性的進(jìn)一步發(fā)展。

接種滅活的、添加佐劑的全細(xì)胞菌苗（單獨(dú)或與抗生素聯(lián)合使用）是目前全球范圍內(nèi)最常使用的，用于控制豬肺炎支原體感染的措 施 (Haesebrouck et al.,2004）。美國(guó)有超過(guò)85%的豬群接種了預(yù)防豬肺炎支原體的疫苗(Thacker and Minion, 2010）。 許多不同的研究報(bào)告已證實(shí)了疫苗接種的有效性。雖然接種疫苗對(duì)受感染的豬群具有積極的效果，但是這種效果在不同的畜群之間存在差異性。這種差異性可能是由于不同的因素，如感染水平、受感染動(dòng)物的日齡、復(fù)雜的因素以及不同豬肺炎支原體分離株之間的變異性所造成的( Calus et al.,2007 and Villarreal et al.,2011）。不過(guò)，接種疫苗仍舊被認(rèn)為是控制該病感染中最有效的措施(Mateusen et al.,2002）。 豬 肺 炎 支原體疫苗的主要優(yōu)勢(shì)包括改善日增重（2%～8%）和飼料轉(zhuǎn)化率（2%～5%）、縮短豬群達(dá)到屠宰體重的時(shí)間、減少臨床癥狀和肺部病變，以及降低治療成本 (Maes et al.,1999）。

商用疫苗一直是全球范圍內(nèi)控制豬肺炎支原體感染的一個(gè)非常重要的手段。雖然這些疫苗確實(shí)具有一定的效果，但是它們只能提供部分保護(hù)，并不會(huì)阻止豬肺炎支原體定植于上皮細(xì) 胞 上 (Thacker et al.,2000）。 一 些研究表明，目前有效的商用疫苗可減少呼吸道中的病原菌數(shù)量( Meyns et a l.,2006 and Villarreal et al.,2011）， 因而降低動(dòng)物的感染水平，以及畜群中病原菌的擴(kuò)散 (Sibila et al.,2007）。雖然疫苗接種可顯著地降低疾病的臨床癥狀和肺部病變，但在豬肺炎支原體的傳播過(guò)程中僅表現(xiàn)出有限的限 制(Meyns et al.,2006 and Villarr eal et al.,2011）。這些研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了，僅僅疫苗接種不足以清除感染豬群中的豬肺炎支原體，并達(dá)到預(yù)期的效果。因此，疫苗接種應(yīng)與其他管理因素相結(jié)合，以達(dá)到最佳的效果 (Haesebrouck et al.,2004）。

根據(jù)特別的畜群和變量的需求，如生產(chǎn)系統(tǒng)、畜群的類(lèi)型、感染情況和養(yǎng)豬生產(chǎn)者的選擇，人們已采用不同的疫苗接種策略（包括單劑量和雙劑量疫苗接種方案）。疫苗接種的決定或不依賴于養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)可行性，以及接種疫苗將帶來(lái)的與疾病所造成的經(jīng)濟(jì)損失有關(guān)的利潤(rùn)(Maes et al.,2008）。

盡管疫苗接種已廣泛應(yīng)用于對(duì)抗豬肺炎支原體，但是其對(duì)病原體的傳播、不同的菌株以及免疫反應(yīng)等多方面的影響尚不清楚，這有待進(jìn)一步的研究。然而，有研究表明，黏膜抗體和全身性免疫反應(yīng)對(duì)于本病的控制非常重要(Thacker et al.,2000）。商用疫苗可誘導(dǎo)血清中特異性抗體的產(chǎn)生，盡管疫苗之間的抗體反應(yīng)可能 有 所 不 同 (Thacker et al.,1998），而且動(dòng)物之間血清轉(zhuǎn)化率的變化范圍可從30%～100%不等(Sibila et al.,2004）。 特 異 性 抗 體的誘導(dǎo)和對(duì)抗肺炎之間的相互關(guān)系還不清楚。豬群人工攻毒試驗(yàn)的結(jié)果表明，血清中的抗體濃度與防護(hù)豬肺炎支原體之間是不相關(guān)的(Thacker et al.,1998）。因此，血清中含有抗體及其濃度水平，似乎并不是評(píng)價(jià)保護(hù)性免疫的最佳方式。

所有有效的商用疫苗都是由滅活的支原體培養(yǎng)物而制成的，而且其中含有不同的佐劑。雖然佐劑具有不同的性質(zhì)，但是一般來(lái)說(shuō)，它們會(huì)刺激和激活機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)對(duì)抗外源物質(zhì)（抗原）。一些佐劑被認(rèn)為是相對(duì)溫和的，如鋁鹽等，而油性佐劑，通常以油劑的形式（油和水的混合），往往具有更強(qiáng)的活性，并可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)被吸收，因此佐劑釋放和刺激的時(shí)間將會(huì)更長(zhǎng)(Yuki and Kiyono, 2003）。 在 商 用疫苗中佐劑成分的差異可能也會(huì)影響誘導(dǎo)疫苗反應(yīng)的種類(lèi)和保護(hù)的水平。

除此之外，目前用于控制豬地方性肺炎的商用疫苗大多數(shù)是以J株為基礎(chǔ)，這種菌株最初是從英國(guó)的一頭豬上分離到。因此，人們會(huì)質(zhì)疑這種菌株是否與世界各地流行的豬肺炎支原體具有相似的特點(diǎn)(Stakenborg et al.,2005 and Vranckx et al.,2011）。在臨床條件下觀察到的疫苗效果的差異性可能是由于，除其他因素外，豬群中流行的菌株與疫苗菌株之間存在抗原的差異。

除了疫苗接種的效果，在新生仔豬的保護(hù)中，母源細(xì)胞免疫和抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的作用尚不完全清楚，而主動(dòng)免疫的潛在干擾則需要更進(jìn)一步的了解。不管母源抗體是否對(duì)疫苗接種的效果存在差異，單有研究報(bào)告指出，單劑量的豬肺支原體疫苗可對(duì)1周齡左右的仔豬誘導(dǎo)產(chǎn)生長(zhǎng)期的保護(hù)性免疫，而且人工感染強(qiáng)毒后肺部的病變程度有所減緩(Reynolds et al.,2009）。當(dāng)來(lái)自不同窩的豬群混養(yǎng)在一起時(shí)一種早期的疫苗接種方案是應(yīng)在斷奶的時(shí)候給予血清轉(zhuǎn)化。這時(shí)候很有可能是它們要面臨第一個(gè)傳染病的挑戰(zhàn)，而當(dāng)有發(fā)展多因素的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，重癥肺炎則可能會(huì)加劇。Meyns et al.(2004）估計(jì)，在為期6周的保育期間，一頭受感染動(dòng)物將平均感染同欄的一頭易感動(dòng)物。因此，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了，從幼年動(dòng)物開(kāi)始實(shí)施防控策略的重要性。

五、新的試驗(yàn)性疫苗

盡管目前使用的疫苗都是以菌苗為基礎(chǔ)，但是關(guān)于其有效性的問(wèn)題依然存在。而且這些疫苗的生產(chǎn)成本也較高，這主要是因?yàn)樨i肺炎支原體在體外難以培養(yǎng)(Kobisch and Friis, 1996）。因此，這有必要研發(fā)更有效且成本更低的豬肺炎支原體疫苗。重組DNA技術(shù)可用來(lái)克服常規(guī)疫苗所遇到的一些問(wèn)題。雖然4株豬肺炎支原體的基因組已被成功測(cè)出( Liu et al.,2011, Minion e t al.,2004 and Vasconcelos et al.,2005），但是幾乎沒(méi)有找到可以作為候選疫苗的重組抗原( Chen et al.,2008, C hen et al.,2003, Fagan et al.,2001 an d King et al.,1997）。這種病原菌的基因組很小，分泌蛋白或表面蛋白的數(shù)量有限，這有利于反向疫苗學(xué)技術(shù)的使用(Rappuoli, 2001）。不過(guò)，支原體屬使用一個(gè)不尋常的遺傳密碼。在大多數(shù)支原體中，色氨酸的編碼子不是TGG，而是TGA，這是一個(gè)終止密碼子(Razin et al.,1998）。這種差異阻礙了豬肺炎支原體含有TGA密碼子的基因在大腸桿菌中表達(dá)，以及最為可行的系統(tǒng)用于重組蛋白的生產(chǎn)(Nuc and Nuc, 2006）。不過(guò)，點(diǎn)突變技術(shù)已可把TGA替換成TGG，從而解決了這個(gè)問(wèn)題。Simionatto et al.（2009）闡述了從豬肺炎支原體的14個(gè)基因中定點(diǎn)突變TGA密碼子的PCR程序的優(yōu)化，是這些基因可在大腸桿菌中克隆和表達(dá)。

目前，科研人員正不斷努力研發(fā)新的疫苗，為預(yù)防豬肺炎支原體的感染提供更好的保護(hù)。一些研究已通過(guò)不同形式的用法和劑型，評(píng)估了豬肺炎支原體的重組蛋白，試圖研發(fā)更有效的疫苗。其中，某些重組蛋白進(jìn)行了單獨(dú)的評(píng)估(Galli et al.,201 2 and Simionatto et al.,2012）， 而 其他則與減毒細(xì)菌或病毒載體相關(guān)聯(lián)(Chen et al.,2006a, Chen et al.,200 6b, Chen et al.,2001, Fagan et al.,2001, Okamba et al.,2010, Okamba et al.,2007, Shimoji et al.,2003 and Zou et al.,2011），或與黏膜佐劑 相 融 合 (Conceicao et al.,2006），又或作為一種抗原的混合物(Chen et al.,2008）。只有少數(shù)一些重組蛋白進(jìn)行了豬的攻毒試驗(yàn)，而大多數(shù)僅在小鼠上進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了這些抗體誘導(dǎo)的免疫存在一定的差異，這可能受到疫苗設(shè)計(jì)、免疫途徑、以及有利于抗原刺激產(chǎn)生抗體的正確折疊和/或其他翻譯后修飾能力的影響(Pinto et al.,2007a）。然而，這些評(píng)估結(jié)果表明，這些新的疫苗可能代表著有前景的新措施，并在控制豬肺炎支原體上可能是經(jīng)濟(jì)可行的。表1總結(jié)了迄今為止用于試驗(yàn)性豬肺炎支原體疫苗的抗原、佐劑、載體和免疫途徑。

粘附素P97蛋白，豬肺炎支原體中一種重要的粘附素，已被廣泛的研究且認(rèn)定為應(yīng)對(duì)豬肺炎支原體最具潛力的保護(hù)性抗原。在一些研究中已采用不同的疫苗制劑對(duì)其進(jìn)行了評(píng)估。King et al.(1997）報(bào)道稱，基于重組粘附素P97蛋白的亞單位疫苗，在豬的攻毒試驗(yàn)中并沒(méi)有產(chǎn)生顯著的保護(hù)效果。不過(guò)，當(dāng)P97蛋白的C末端區(qū)域（R1）與假單胞菌毒素相融合以后，免疫的小鼠和豬均對(duì)R1能產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答(Chen et al.,2001）?？诜庖咧亟M紅斑丹毒絲菌表達(dá)的P71蛋白，可降低由豬肺炎支原體感染引起的肺部病變的嚴(yán)重程度，這表明，紅斑丹毒絲菌可能是一個(gè)有前景的疫苗載體，可搭載外來(lái)抗原至豬的免疫系統(tǒng)(Ogawa et al.,2009）。

除了疫苗中的抗原以外，佐劑和免疫途徑在免疫保護(hù)中也發(fā)揮著重要的作用。黏膜佐劑和滴鼻免疫接種作為替代傳統(tǒng)免疫的方式尤為受到人們關(guān)注，這可能會(huì)提高黏膜免疫力。Conceicao et al.(2006）的報(bào)道稱，一種將具有黏膜免疫佐劑作用的不耐熱腸毒素B亞單位與P97蛋白的R1亞單位相融合的重組亞單位疫苗，在小鼠中對(duì)R1可產(chǎn)生全身性和黏膜性抗體。而Shimoji et al.(2003）的報(bào)道稱，當(dāng)給豬群進(jìn)行人工感染時(shí)，紅斑丹毒絲菌表達(dá)的P97蛋白的R1區(qū)域可將降低鼻內(nèi)免疫豬群的肺部病變的嚴(yán)重程度。然而，這沒(méi)有產(chǎn)生體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。此外，Okamba et al.(2007）的研究結(jié)果表明，小鼠鼻內(nèi)免疫缺陷型腺病毒表達(dá)的P97蛋白的C末端區(qū)域(rAdP97c），可誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)性Th1/Th2免疫反應(yīng)和局部免疫。與此相同的方法在豬上也進(jìn)行了評(píng)估，并與一些商用疫苗作了比較。結(jié)果顯示，rAdP97c可顯著降低炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，以及呼吸道中豬肺炎支原體的數(shù)量。而且平均日增重也略有改善。不過(guò)，商用疫苗可更有效第誘導(dǎo)保護(hù)性免疫(Okamba et al.,2010）。這些結(jié)果表明，這種抗原誘導(dǎo)的免疫可能受到疫苗設(shè)計(jì)、免疫途徑，以及所使用的佐劑或載體的影響。

研究顯示，給小鼠口服免疫含有P97蛋白R(shí)1區(qū)域的鼠傷寒沙門(mén)氏菌aroA CS332和豬肺炎支原體的核苷酸還原酶（NrdF）R2亞單位的疫苗，可產(chǎn)生Th1細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫反應(yīng)，但不會(huì)產(chǎn)生體液或黏膜免疫反應(yīng)。然而，在鼠傷寒沙門(mén)氏菌aroA SL3261中表達(dá)NrdF的R2亞單位，可在免疫小鼠中發(fā)現(xiàn)黏膜免疫反應(yīng)(Fagan et al.,1997）。而當(dāng)用于免疫豬群時(shí)，這種抗原能夠降低豬肺炎支原體攻毒感染所引起的肺部病變(Fagan et al.,2001）。

表1 試驗(yàn)性豬肺炎支原體疫苗的信息表

除了重組亞單位疫苗以外，相關(guān)研究也對(duì)DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于熱休克蛋白P42的DNA疫苗對(duì)小鼠可產(chǎn)生顯著的免疫反應(yīng)。小鼠的DNA免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的免疫反應(yīng)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，受免疫動(dòng)物的血清可抑制豬肺炎支原體的生長(zhǎng)(Chen et al.,2003）。一些研究觀察到，含有P46抗原的DNA疫苗也具有相類(lèi)似的功效。不僅可在免疫小鼠中產(chǎn)生Th1和Th2免疫反應(yīng)，而且還可增加干擾素-γ的 水 平 (Galli et al.,2012）。DNA 疫苗可能具有一定的應(yīng)用前景，以制定更有效的豬肺炎支原體疫苗。

盡管這些抗原具有免疫特性以及肺部病變的嚴(yán)重程度有所下降，但目前它們其中沒(méi)有一個(gè)能夠像商用疫苗一樣，可提供全面的保護(hù)或類(lèi)似的保護(hù)效果。多價(jià)疫苗也是預(yù)防豬肺炎支原體的另一個(gè)很好的選擇(Chen et al.,2008）。相關(guān)研究評(píng)價(jià)了豬肺炎支原體的5個(gè)重組抗原(P97、P97R1、NRDF、P36和 P46）作為DNA和蛋白質(zhì)疫苗的效果。小鼠免疫抗原混合物（DNA疫苗）的分析結(jié)果顯示，只有P97和P36蛋白可誘導(dǎo)血清IgG抗體的產(chǎn)生。肌注免疫抗原混合物（DNA疫苗）則可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，而這抗體反應(yīng)似乎是抗原依賴的。皮下免疫相同的抗原混合物（重組亞單位疫苗）可誘導(dǎo)體液免疫和Th1細(xì)胞免疫的產(chǎn)生。當(dāng)DNA疫苗和亞單位疫苗聯(lián)合使用時(shí)，機(jī)體可同時(shí)產(chǎn)生體液免疫和Th1細(xì)胞免疫。此外，商用疫苗免疫產(chǎn)生的血清抗體不能識(shí)別P97蛋白，這可能意味著在滅活全細(xì)胞菌苗中缺乏這種抗原的表達(dá)(Chen et al.,2008）。

免疫原性豬肺炎支原體蛋白的鑒定和特定性描述對(duì)疫苗的改良來(lái)說(shuō)是非常重要的一步。雖然支原體中不尋常的密碼子可能會(huì)導(dǎo)致這個(gè)過(guò)程非常困難(Razin et al.,1998），但是S imionatto et al.,2009 and Simiona tto et al.,2010和Marchioro et al.(2012）曾報(bào)道豬肺炎支原體的基因可在大腸桿菌中成功地克隆和表達(dá)。根據(jù)重組蛋白34的抗原性和免疫原性，預(yù)測(cè)其是表面暴露的，或分泌豬肺炎支原體介導(dǎo)宿主細(xì)胞相互作用的重組蛋白，而且經(jīng)檢測(cè)這是宿主免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)。這些抗原在小鼠中的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，它們具有作為預(yù)防豬肺炎支原體感染的候選疫苗的潛能(Simionatto et al.,2012）。 雖 然 小 鼠的免疫反應(yīng)不能外推到其他物種，但這些結(jié)果對(duì)進(jìn)一步的臨床研究提供了數(shù)據(jù)參考。

六、結(jié)論與展望

雖然采用藥物措施和/或預(yù)防免疫接種，結(jié)合管理措施和欄舍條件的優(yōu)化已給豬群的健康帶來(lái)很大的改善，但是這些措施并不能完全保證沒(méi)有豬肺炎支原體的感染。目前的措施不能對(duì)本病提供可持續(xù)的控制策略，不過(guò)從經(jīng)濟(jì)利益來(lái)說(shuō)這些措施還是有作用的。

商用疫苗可用來(lái)限制豬肺炎支原體的感染，不過(guò)確切的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚?？蒲腥藛T已努力研發(fā)一種更有效的豬肺炎支原體疫苗，而一些研究結(jié)果表明，重組DNA疫苗似乎是一種可行的替代方案。此外，無(wú)論是保護(hù)還是損傷的誘導(dǎo)，研究宿主的免疫應(yīng)答，以了解其發(fā)揮的作用顯然是非常重要的。未來(lái)的研究將在家豬中確定新的候選疫苗的效果，并且更好地了解它們的作用模式。