布鳴

廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022

石芽茶為山茶科楊桐屬植物亮葉楊桐Adinandra nitida Merr.ex Li的干燥葉，俗稱石崖茶。石芽茶中黃酮類化合物主要包括山茶苷A、山茶苷B和芹菜素等，其中山茶苷A的含量為最高，占總黃酮中90%以上[1-2]，但目前未見到有關(guān)其山茶苷A含量測(cè)定的報(bào)道。本課題組報(bào)道了石芽茶的槲皮苷含量測(cè)定及指紋圖譜研究.[3-4]，現(xiàn)對(duì)不同產(chǎn)地的11批石芽茶藥材采用反相高效液相色譜法測(cè)定山茶苷A的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)研究，結(jié)果準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)便，為石芽茶的藥用開發(fā)提供一定的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20ATVP液相色譜儀；日本島津SPD-20AVP檢測(cè)器；威瑪龍色譜工作站及軟件5.20版。山茶苷A對(duì)照品(自制，純度≧98%)；水為重蒸餾水(自制)；乙腈為色譜純，其余均為分析純?cè)噭?。石芽茶樣品?0090204、20090711、20090712、20090711、20090802、20091118、20091210、20091215、20091221，由本院中藥所黃云峰同志采集；20090605、20110311由金秀縣科技情報(bào)所梁干君同志采集，以上樣品均由本院中藥所鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：XB-C18柱 (4.6 mm×250mm，5um)；檢測(cè)波長(zhǎng)：330m；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(20:80)；流速1.0ml·min-1；柱溫為室溫，理論塔板數(shù)按山茶苷A峰計(jì)算不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取山茶苷A對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含80μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品藥材粉末0.1g(過60目篩)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足缺失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液4ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍考察 精密稱取山茶苷A對(duì)照品20.2mg，置25ml量瓶中用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成808μg/ml對(duì)照品溶液，備用。精密吸取上述對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml，分別置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣10μl，測(cè)定，計(jì)算，以對(duì)照品進(jìn)樣濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=26262X+20958，r=1.000。結(jié)果表明：山茶苷A進(jìn)樣濃度在20.2～323.2μg/ml之間與峰面積積分值線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一份石芽茶供試品溶液(批號(hào)110311)10μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定山茶苷A峰面積，其RSD為1.71%(n=5)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(110311)樣品，按供試品溶液制備方法制備6份，分別進(jìn)樣，測(cè)定，即得。結(jié)果測(cè)得山茶苷A平均含量為68.2mg/g，RSD= 0.53%(n=6)。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)110311)分別于配置后0、4、8、12、16h進(jìn)行測(cè)定，即得。結(jié)果供試品中山茶苷A含量的RSD為1.43%，表明供試品溶液在16h內(nèi)保持穩(wěn)定(n=5)。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知含量的同一批號(hào)供試品0.05g(含量：68.2mg/g)6份，加入1.012mg/ml山茶苷A對(duì)照品溶液3.4ml，再加入甲醇22.6ml，按供試品制備項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，測(cè)定，結(jié)果山茶苷A平均回收率為98.8%，RSD%為1.62 (n=6)，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)測(cè)量結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測(cè)定 取不同地區(qū)的11批石芽茶藥材，按供試品溶液制備方法制備，分別進(jìn)樣10μl；同時(shí)取對(duì)照品溶液10μl，進(jìn)樣測(cè)定。按外標(biāo)法(峰面積)計(jì)算石芽茶中山茶苷A的含量。結(jié)果見表2。

表2 11批石芽茶藥材中山茶苷A的測(cè)量結(jié)果

t/min A． 山茶苷

t/min B. 石芽茶藥材

3 討論

3.1 山茶苷A作為石芽茶的主要黃酮成分，含量較高，測(cè)定山茶苷A的含量可作為控制本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)之一。由于其測(cè)定使用的流動(dòng)相系統(tǒng)與槲皮苷一致[3]，只是最大紫外吸收波長(zhǎng)不同，原擬定與槲皮苷一同測(cè)定，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用50%甲醇提取所得槲皮苷含量比用甲醇高，且雜質(zhì)較少；采用甲醇提取所得山茶苷A含量比用50%甲醇高，因此兩者最佳提取溶劑不同，故把這兩者分開測(cè)定。

3.2 對(duì)山茶苷A進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果其在330nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm，根據(jù)試驗(yàn)摸索，以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相，考察不同比例，最后確定乙腈-0.1%磷酸(20:80)的比例較為適合。

3.3 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，本分析方法精密度高，準(zhǔn)確度、重復(fù)性都比較好，并且操作簡(jiǎn)便、快捷，為石芽茶的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了良好的依據(jù)。

[1] 劉本國(guó).亮葉楊桐葉中類黃酮的提取、鑒定與修飾[D].廣州，華南理工大學(xué)，2007.

[2] 劉本國(guó)，戰(zhàn)宇，許克勇，等.液質(zhì)聯(lián)用鑒定石芽茶中的類黃酮化合物[J].食品研究與開發(fā)，2007，28(3)：118-120.

[3] 宋志釗，劉元，李文琪.HPLC法測(cè)定亮葉楊桐葉中槲皮苷的含量[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2011，20(5)：27-28

[4] 劉元，宋志釗，李文琪.亮葉楊桐指紋圖譜研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(6)：71-73.