李 明，王樹香，高寶嘉

(1.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，保定 071000;2.河北農(nóng)業(yè)大學林學院，保定 071000)

油松(Pinus tabulaeformis Carr.)是我國特有樹種，分布全國14個省(自治區(qū))［1］，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟價值，是我國北方天然油松分布區(qū)的主要建群種，同時也是我國北方地區(qū)治理水土流失、改善生態(tài)環(huán)境的重要造林樹種［2］。近年來，人們對油松天然林進行了大量利用，加之氣候影響，大面積的油松天然林遭到破壞，甚至消亡。因而，迫切需要對油松天然林遺傳資源進行保護，以防止其優(yōu)良基因和遺傳多樣性喪失。在上世紀中后期徐化成等從形態(tài)特征、化學成分及分布特征等方面做了大量關于油松天然林的地理變異研究［3-5］，認為生長特性與緯度呈負相關，與年均溫呈正相關，同時形態(tài)指標、抗逆指標又存在地理變異的不連續(xù)性，并對油松種源的20個特征進行了遺傳變異研究，劃分了7個生態(tài)型。在油松的分子遺傳方面，張春曉、李悅等采用水平淀粉凝膠電泳方法研究了油松遺傳多樣性指數(shù)與海拔、年降雨量存在相關關系［6-7］;王磊等利用隨機微衛(wèi)星擴增多態(tài)性DNA(RMAPD)分子標記技術，揭示了油松各天然居群間存在較高遺傳多樣性差異［8］;李毳、柴寶峰等用酸性聚丙烯酰胺凝膠(APAGE)技術分析了華北地區(qū)油松居群在醇溶蛋白及分子水平的遺傳特征［9-10］。近年來，李明、張靜潔等采用ISSR標記技術對油松種質資源保護、遺傳多樣性與生境環(huán)境作了一定研究，認為不同海拔生境及土壤因子影響下，其天然次生林存在明顯變異規(guī)律［11-12］;王孟本、Eckert等通過對不同居群油松與環(huán)境因子研究，認為不同油松居群間遺傳分化顯著，遺傳多樣性指數(shù)與年均溫、年降雨量不存在顯著相關性［13-15］。系統(tǒng)研究產(chǎn)地環(huán)境因子與油松天然次生林遺傳變異的關聯(lián)以及地理變異規(guī)律將對油松種質資源的保護和利用具有重要的理論意義。本研究采用ISSR技術對油松天然群體遺傳多樣性變異進行研究，據(jù)此分析其與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境因子的關聯(lián)，從而更清楚地認識和預測天然油松次生林分子特征的地理變異規(guī)律，并為正確、合理利用與保護天然油松種質資源提供基礎資料和科學依據(jù)。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 野外取樣

2011年7底到8月初，于河南、山東、河北、寧夏、山西、陜西、甘肅、遼寧等8省10地區(qū)的油松天然次生林中取樣。每居群取25株個體，每兩個體間距大于50 m，共250個樣本。采集當年生新鮮針葉，將針葉放入保鮮盒中帶回，置于-20℃冰箱保存。其中，經(jīng)緯度、海拔由GPS測得，年平均氣溫、極端最高溫、極端最低溫、年降雨量、年日照時數(shù)等氣象因子由各居群所在地氣象站資料計算得到，各采樣點位置及氣象數(shù)據(jù)如表1。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取和反應體系

采用UNIQ-10柱式新型植物基因組DNA抽提試劑盒(購自上海生物工程有限公司)提取DNA，并稀釋成終濃度20 ng/μL，放入-20℃冰箱儲存?zhèn)溆?。根?jù)加拿大哥倫比亞大學公布的100條ISSR標記序列(http://www.biotech.ub.ca/services/naps/primers/Primers.pdf)，篩選出 13 個重復性好、特異性高的引物用于 ISSRPCR反應［12］，ISSR引物由上海生物工程有限公司合成。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后，在UVP凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

以產(chǎn)生分子量為100—2000 bp的Marker DL2000(寶泰克)為標準譜帶，有帶記作“1”，無帶記作“0”。假設群體處于哈迪-韋伯平衡，利用POPGENE 1.32和GENAlEX6.3軟件對譜帶進行遺傳特征分析，分別計算:(1)觀測等位基因數(shù)Na;(2)有效等位基因數(shù)Ne;(3)期望雜合度He;(4)Shannon信息指數(shù)I;(5)多態(tài)位點百分率P;(6)總基因多樣度Ht;(7)居群內(nèi)基因多樣度Hs。

應用SPSS 18.0軟件進行Pearson相關性分析，應用POPGENE軟件以UPGMA法對居群間的親緣關系進行聚類分析，并繪制聚類圖。

2 結果與分析

2.1 油松天然居群遺傳多樣性

13個ISSR引物共擴增出137個多態(tài)位點，平均多態(tài)位點百分率60.72%，總的多態(tài)位點百分率100%，平均每條引物擴增10.54條譜帶(表2)，絕大多數(shù)譜帶集中在400—1600 bp(圖1)。不同油松居群的總基因多樣度(Ht)為0.3461，其中存在于居群內(nèi)的基因多樣度(Hs)為0.2162，居群間的基因多樣度(DST)為0.1299。不同居群間的遺傳分化系數(shù)(GST)為0.3753，表明大部分分子變異發(fā)生在居群內(nèi)(62.47%)。一般風媒傳粉的異交木本植物居群間變異占總變異的10%左右，油松與之相比，顯然是偏高的。根據(jù)Nm=0.5(1-Gst)/Gst計算出不同生境下的油松居群基因流(Nm)為0.8323，說明居群間存在有限的基因交流。

表2 ISSR擴增引物、序列及擴增結果Table 2 ISSR primer labels，primer sequences and amplification results

圖1 ISSR引物(826)對蘇峪口居群部分個體的擴增結果Fig.1 The profiles of SDC population using the ISSR primer(826)

由表3可知，各居群間 Shannon信息指數(shù)變化范圍在0.1923—0.2490，平均值(0.2165)與 Nybom［21］所統(tǒng)計的多種植物種群水平的遺傳多樣性(基于RAPD和ISSR等顯性標記)平均值(0.22)相似;各居群間期望雜合度He變化范圍在0.2824—0.3702，其中山西和順云龍公園居群最高，甘肅冶力關居群最低，與觀測等位基因數(shù)變化趨勢基本一致;多態(tài)位點百分率以河南寶天曼油松居群最高(71.53%)，山西和順云龍公園居群次之(70.7%)，甘肅冶力關居群最低(51.09%)。

表3 油松天然居群遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameters of Pinus tabulaeformis populations

2.2 油松居群ISSR差異帶數(shù)分析

10個油松天然居群中，13條引物擴增出差異帶數(shù)最少為84條(DWP)，最多為127條(YLGY)，各油松天然居群擴增譜帶及頻率存在較大的變異。另外，在差異帶數(shù)出現(xiàn)頻率很低(≤25%)時，少數(shù)居群如YLG、SYK、DWP三居群沒有擴增特異條帶，說明三居群變異程度低;而YLGY居群有3條，YWL和LKS居群各有2條，其它居群各1條(表4)，說明這些油松天然次生林居群具有更豐富的變異基礎。在使用的引物中，SDC居群有1條特異性擴增條帶，為該居群種質資源的變異特性研究提供了重要前提。

表4 油松居群ISSR差異帶數(shù)分析Table 4 Different bands for ISSR data of Pinus tabulaeformis populations

2.3 油松天然居群間的遺傳距離和UPGMA分析

表5顯示，10個天然油松居群間的遺傳距離(D)變化范圍為0.083(LKS-CJC)—0.2939(SDC-DWP)，地理距離變化范圍為110.9252 km(LKS-SDC)—1741.0933 km(YWL-YLG)。經(jīng)Mantel檢驗，10個居群間的地理距離和遺傳距離不存在顯著相關性(r=0.069，P=0.360)，說明地理隔離不是遺傳變異的主要原因，而產(chǎn)地環(huán)境因子長期脅迫，可能使油松居群發(fā)生一定程度的地理適應性分化。

表5 油松居群間遺傳距離(對角線下方)和地理距離(對角線上方)/kmTable 5 Nei's genetic distance(below diagonal)and geographic distance(above diagonal)/km of Pinus tabulaeformis populations

根據(jù)Nei無偏遺傳距離構建居群間UPGMA聚類圖(圖2)顯示，10個油松天然居群共聚成3大類:河南寶天曼(BTM)、承德大窩鋪(DWP)、寧夏蘇峪口(SYK)和甘肅冶力關(YLG)居群聚為一類，遼寧醫(yī)巫閭(YWL)、山西沁源靈空山(LKS)、陜西蔡家川林場(CJC)、山西和順云龍公園(YLGY)和山西汶水三道川林場(SDC)居群聚為一類，山東蒙山(MS)居群獨立為一類。

圖2 10個天然油松居群基于Nei's(1972)遺傳距離聚類圖Fig.2 Dendrogram based Nei's(1972)genetic distance of 10 Pinus tabulaeformis populations

2.4 油松天然居群遺傳多樣性及與產(chǎn)地環(huán)境因子相關性分析

進一步對油松天然居群遺傳多樣性與產(chǎn)地環(huán)境因子進行相關性分析(表6)，油松天然居群的觀測等位基因數(shù)(Na)及多態(tài)條帶百分率(P)與年平均氣溫、1月平均氣溫、極端最低溫等產(chǎn)地氣候因子呈顯著正相關，與海拔呈顯著負相關。Shannon信息指數(shù)(I)與海拔(r=-0.5788)、極端最高溫(r=0.5289)及年降雨量(r=-0.5512)呈顯著相關，即隨著極端最高溫升高、海拔降低、年降雨量減少，Shannon信息指數(shù)升高。

表6 油松居群遺傳參數(shù)與環(huán)境因子相關性Table 6 The relationships between genetic diversity parameters of Pinus tabulaeformis populations and environmental factors

3 結論與討論

3.1 油松天然居群的遺傳多樣性與環(huán)境因子相關性

油松居群的平均多態(tài)位點百分率60.72%，總的多態(tài)位點比率為100%，變異幅度范圍為55.47%—71.53%，表明油松在種水平上具有較高的遺傳多樣性。Wright［17］認為居群間基因流大于1能發(fā)揮其均質化作用，反之，則表明基因流成為遺傳分化的主要原因。本研究天然油松林的基因流為0.8323，說明不同產(chǎn)地環(huán)境的長期影響，可能造成天然油松居群間基因流較小，是居群間遺傳分化重要原因。居群間遺傳變異占總變異的37.53%，表明居群間已產(chǎn)生較大程度的分化。故表明居群間地理及環(huán)境因子的差異，可能使花粉的傳播受到較大程度的阻礙，從而限制了居群間的隨機交配，居群間遺傳分化越來越明顯。

本研究的目的之一是分析油松居群遺傳多樣性及與生態(tài)因子間相關性。13條引物擴增的多態(tài)條帶比率非常高(100%)，在137個ISSR擴增譜帶中，特有條帶1條(山西三道川林場)，頻率≤25%差異條帶數(shù)量1—3條，頻率≤50%差異條帶數(shù)量7—24條，出現(xiàn)頻率≥5%的差異帶數(shù)76—125條，從而進一步說明作為分布于我國北方各省的廣布種，天然油松次生林具有極豐富的基因多態(tài)性。一般認為一個物種的遺傳多樣性愈豐富，對環(huán)境變化的適應性就愈大［18］，油松天然居群間遺傳結構的差異有利于油松提高抵御不良環(huán)境的能力，擴展其分布范圍，增強其適應性。很多學者對不同植物居群進行了環(huán)境因子與遺傳多樣性指數(shù)間的相關性研究，發(fā)現(xiàn)居群遺傳多樣性與產(chǎn)地海拔、溫度、降雨量、土壤礦物質含量等因子間存在一定的相關關系［16，19-24］，說明環(huán)境脅迫影響下，導致譜帶頻率和遺傳多樣性發(fā)生一定程度的梯度變化，引起相應的適應性生態(tài)地理分化。有大量研究［25-27］指出，植物抗寒性并非由單一基因控，是由多種特異的數(shù)量性抗寒基因調控的。本研究結果顯示(表6)，隨著產(chǎn)地年平均氣溫、極端最低溫的降低，天然油松林居群的觀測等位基因數(shù)量及多態(tài)位點百分率顯著降低，Shannon信息指數(shù)與降雨量呈現(xiàn)顯著負相關，從而說明低溫和降雨量影響了抗逆相關基因數(shù)量的表達，對天然油松次生林ISSR多態(tài)性產(chǎn)生選擇壓力。這與借助RAPD、等位酶等標記技術對其它植物的研究結果相似［19-20，22-23］?？傊瑢е掠退商烊痪尤洪g遺傳分化的原因除了與自然選擇及居群間缺乏有效的基因流有關外，還可能與生物學特性及其它原因有關，故遺傳分化—自然選擇—生物學特性三者間關聯(lián)性有待進一步研究探討。

3.2 油松天然居群遺傳多樣性地理變異模式

20世紀七八十年代，徐化成等對油松生長、表型性狀與地理-氣候因素關系進行了系統(tǒng)研究，認為生長特性與年均溫具有關聯(lián)性，油松在形態(tài)學水平的地理變異具有隨機性［1-5］。本研究從DNA水平研究得到不同結論，即產(chǎn)地氣溫、海拔和降雨量等產(chǎn)地氣候因子是影響天然油松次生林遺傳變異的重要環(huán)境因子，而不同經(jīng)緯度產(chǎn)地的本質是其氣候條件的差異，與產(chǎn)地氣候因子相關也就意味著存在一定的地理模式，進而說明油松天然居群基因水平的地理變異并不是完全隨機的，具有一定的規(guī)律性?；赨PGMA聚類分析顯示，作為天然油松林分布中心的太行山脈、呂梁山脈及黃龍山脈的天然油松次生林相似性高，而分布于其它地域天然油松林具有一定的獨立遺傳特征。Shannon多樣性指數(shù)(I)和多態(tài)位點百分率(P)可評價遺傳多樣性的高低，指數(shù)越大，表明居群的遺傳多樣性水平越高。山西和順云龍公園、河南寶天曼及遼寧醫(yī)巫閭居群的Shannon信息指數(shù)及多態(tài)位點百分率均較高，并地處中國地勢二級和三級地勢階梯分界線附近，即油松天然居群分布區(qū)南北向中軸區(qū)域，故推測三居群與其它居群受季風影響種子及花粉交流相對頻繁，基因多態(tài)性水平高;而山東蒙山、甘肅冶力關居群相對獨立，說明該居群環(huán)境限制了與其它居群的交流，遺傳特征獨特，Shannon信息指數(shù)及多態(tài)位點比率均較低。由此進一步說明，油松天然居群遺傳變異存在一定的地理變異模式。

森林樹種應對環(huán)境脅迫表現(xiàn)出明顯的表型適應性，而關于基因區(qū)域的中性標記是否作為植物適應性的選擇始終具有爭論，Neale和Kremer［28］認為，森林基因組學將為適應環(huán)境脅迫的功能基因的研究提供重要工具，研究結果將為適應性遺傳變異的中性選擇理論提供科學依據(jù)［29-30］。本研究結果借助隨機性ISSR標記，說明不同環(huán)境脅迫下油松天然次生林群體多態(tài)性差異和遺傳分化較大，反映油松天然居群一定的地理變異趨勢，雖不能準確反映與當?shù)丨h(huán)境適應的生長、抗性、形態(tài)等指標功能基因的變異趨勢，但為中性標記的適應性選擇理論提供了重要支持。

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