3個居群野生草地早熟禾耐鹽性比較研究

張 燕， 朱慧森， 白永超， 黃志超， 胡 婧， 董寬虎， 李存福

(1. 山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所， 山西 太原 030032； 2. 山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院， 山西 太谷 030801；3. 全國畜牧總站， 北京 100125)

土壤鹽漬化問題已成為環(huán)境的主要問題之一[1-2]，據(jù)統(tǒng)計，我國鹽漬土面積約為3 460萬hm2 [3]，其中山西省鹽堿地約26.18萬hm2，占平川總土地面積的9.9%[4]。山西地處內(nèi)陸地區(qū)，由于降水量稀少，淋溶作用弱，地表和地下水蒸發(fā)強烈，再加上不合理的灌溉，使土壤的鹽漬化和次生鹽漬化問題越來越嚴重。隨著城市綠地面積需求的日益擴大，大面積的鹽漬土壤用于建植草坪，常常造成出苗困難、生長緩慢、整齊度差或者返青延遲、秋季早衰、禿斑甚至死亡的現(xiàn)象[5]。

草地早熟禾是目前世界上應用最為廣泛的冷季型草坪建植材料。草地早熟禾建植區(qū)域常出現(xiàn)因土壤自身鹽漬化、灌溉水的含鹽量高或排水設施不健全或不暢而造成的植株稀疏、斑禿等現(xiàn)象。草坪草的抗鹽性直接表征其對鹽脅迫的反應及適應性。目前，針對草地早熟禾草坪鹽脅迫的研究已有報道：Dai等研究了鹽脅迫對草地早熟禾萌發(fā)及生長的影響[6-9]；Xu等研究了鹽脅迫對草地早熟禾生理生化特性的影響[10-12]；Bushman等研究了鹽脅迫下草地早熟禾轉錄組和基因表達的差異[13-15]；另外還有學者研究了一些外源物質(zhì)對鹽脅迫下草地早熟禾的緩解效應[16-21]。但以上工作主要集中在引進草地早熟禾品種，相關具有優(yōu)良耐鹽基因的野生草地早熟禾種質(zhì)的耐鹽性研究較少。

山西省地域廣闊，野生草地早熟禾資源極其豐富[22]，本課題組近幾年收集了山西境內(nèi)49個居群的野生草地早熟禾，并對其進行了種質(zhì)資源評價、農(nóng)藝性狀、遺傳多樣性以及耐旱、耐熱等方面的研究[23-28]，本文選取了坪用性狀和抗旱性表現(xiàn)較好的3個居群進行NaCl溶液脅迫試驗，研究草地早熟禾對NaCl脅迫的耐受閾值及生理響應機制，為今后引種馴化耐鹽品種及鹽堿地區(qū)草坪草的建植管理提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗在山西農(nóng)業(yè)大學動物科技試驗站日光能溫室進行(37°25′ N，112°23′ E，海拔799 m)，屬晉中盆地，光能資源豐富，日光能溫室平均溫度15～30℃，相對濕度60%～80%。

1.2 試驗材料

試驗材料為山西3個不同居群野生草地早熟禾，于2009年和2010年分別采集于山西渾源縣懸空寺路邊(39°36′ N,113°42′ E，海拔1 184 m)，以HY表示；山西應縣西米莊村河邊(39°36′ N,113°07′ E，海拔993 m)，以YX表示、山西沁水縣南河村路邊(35°32′ N,111°59′ E，海拔1 311 m)，以QS表示。

1.3 試驗設計

2015年9月10日將3個居群野生草地早熟禾種子在日光能溫室中育苗，育苗盤72孔，育苗基質(zhì)為過篩無雜質(zhì)細土壤，種子均勻播種后在表層撒無雜質(zhì)細沙0.5 cm。育苗前期保持土壤充分濕潤，晝夜日均溫控制在(25±2℃)/(15±2℃)。

播種48 d后，將植株移栽到裝有同等重量基質(zhì)的無孔塑料盆(直徑25 cm、高20 cm)中，基質(zhì)為沙子(過篩后水洗曬干)與珍珠巖(體積比3:1，充分混勻)的混合物。每盆中預先插入直徑1 cm、長25 cm的PVC管，澆水、營養(yǎng)液和NaCl溶液時直接順著管口流入盆底，每盆均勻移栽65株。待植株完全成活后，每盆間至50株，并且每7 d用Hoagland營養(yǎng)液[29]澆灌。移栽45 d后，將其修剪至相同高度，用分析純NaCl加蒸餾水配置濃度0(CK)、50 mmol·L-1、100 mmol·L-1、150 mmol·L-1、200 mmol·L-1、250 mmol·L-1、300 mmol·L-1的NaCl溶液，按預先實驗盆土最大持水量的70%進行澆灌，各處理重復3次。脅迫期間每天進行稱重，用蒸餾水補充損失水分，以保證每盆中鹽濃度恒定。

1.4 樣品的采集

脅迫26 d后用CI-340光合測定儀測定草地早熟禾幼苗從頂部向下展開的第2～3片葉的光合參數(shù)。同時采集新鮮葉片測定相對含水量和質(zhì)膜相對透性，其它材料液氮冷凍，-70℃冰箱中貯存，待測。

1.5 測定指標及方法

采用稱重法[30]測定葉片相對含水量(relative water content，RWC)，氮藍四唑(NBT)光還原法[30]測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，酸性茚三酮法[30]測定脯氨酸(Pro)含量，可溶性糖(soluble sugar，SS)含量測定采用蒽酮比色法[30]，可溶性蛋白(soluble protein，SP)含量測定采用考馬斯亮藍法[30]，硫代巴比妥酸法[30]測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，電導法[31]測定質(zhì)膜相對透性。光合參數(shù)的測定包括凈光合速率(Pn)，氣孔導度(Gs)，蒸騰速率(Tr)，胞間CO2濃度(Ci)等，每個處理重復3次。

1.6 耐鹽性綜合評價方法

采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對不同居群野生草地早熟禾進行耐鹽性綜合評價，利用以下公式進行標準化處理：

(1)與耐鹽性正相關的指標用隸屬函數(shù)

X(U)= (X - Xmin) /(Xmax- Xmin)

(2)與耐鹽性負相關的指標用反隸屬函數(shù)

X(U)= 1 - (X - Xmin) /(Xmax- Xmin)

式中，X為某一耐鹽指標的實際測定值，Xmax為該指標的最大值，Xmin為該指標的最小值。

先求出各個居群的不同耐鹽指標在不同鹽濃度下的隸屬值，然后把每一指標在不同濃度下的隸屬值累加求平均值，再將每個居群各耐鹽指標的隸屬值累加，求其平均值，平均值越大，說明耐鹽性越強[32]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003處理原始數(shù)據(jù)，計算各指標的平均值、標準差和變異系數(shù)，用SAS 9.2軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對野生草地早熟禾葉片相對含水量的影響

從圖1可以看出，隨著NaCl濃度的增加，3個居群草地早熟禾葉片相對含水量均呈現(xiàn)下降趨勢。當鹽濃度為50 mmol·L-1時，3個居群葉片相對含水量與對照相比均無顯著性差異，說明此濃度的鹽脅迫對野生草地早熟禾影響較小；當鹽濃度為100 mmol·L-1及以上時，3個居群葉片相對含水量均顯著低于對照(P<0.05)，且隨著鹽濃度的增加，居群間差異增大，當NaCl濃度為300 mmol·L-1時，3個居群之間差異達顯著水平(P<0.05)，與對照相比，QS居群、YX居群和HY居群葉片RWC分別降低了38.9%，31.3%和18.8%。

2.2 NaCl脅迫對野生草地早熟禾質(zhì)膜相對透性的影響

由圖2可以看出，隨著NaCl濃度的增加，3個居群草地早熟禾葉片質(zhì)膜相對透性均呈增加趨勢。在鹽濃度為50 mmol·L-1和100 mmol·L-1時，3個居群葉片質(zhì)膜相對透性與對照相比均無顯著性差異；但當鹽濃度為150 mmol·L-1及以上時，3個居群葉片質(zhì)膜相對透性均顯著高于對照(P<0.05)，且隨著鹽濃度的增加，居群間差異增大，均表現(xiàn)為QS居群>YX居群>HY居群，當NaCl濃度為300 mmol·L-1時，QS居群、YX居群和HY居群的質(zhì)膜相對透性分別為對照的7.4倍,7.1倍和4.2倍。

圖1 NaCl脅迫下3個居群草地早熟禾葉片相對含水量Fig. 1 RWC of leaves in three wild Poa pratensises accessories under NaCl stress注：不同大寫字母表示同一鹽濃度不同居群間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一居群不同鹽濃度下差異顯著(P<0.05)。下同Note：Different uppercases indicate significant difference between different accessories in the same concentration of NaCl at the level of 0.05；different lowercases indicate significant difference of the same accessory between different concentrations of NaCl at the level of 0.05. The same as below

圖2 NaCl脅迫下3個居群草地早熟禾葉片質(zhì)膜相對透性Fig.2 Relative permeability of plasma membrane of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對野生草地早熟禾SOD活性的影響

由圖3知，隨NaCl脅迫濃度的升高，YX、QS兩個居群野生草地早熟禾的SOD活性均呈先升高后降低的趨勢，分別于250 mmol·L-1和200 mmol·L-1時活性最大，而HY居群則呈逐漸升高的趨勢。在脅迫濃度為50 mmol·L-1時，3個居群野生草地早熟禾SOD活性均與對照無顯著差異；當脅迫濃度為150 mmol·L-1及以上時，3個居群的SOD活性均顯著高于對照(P<0.05)；在NaCl脅迫濃度為0和300 mmol·L-1時，3個居群間SOD活性差異均顯著(P<0.05)。

圖3 NaCl脅迫下3個居群草地早熟禾SOD活性Fig.3 SOD activities of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.4 NaCl脅迫對野生草地早熟禾MDA含量的影響

從圖4可以看出，隨著NaCl脅迫濃度的升高，3個居群野生草地早熟禾MDA含量均呈升高趨勢，3個居群中HY居群MDA含量上升速度較為平穩(wěn)。當鹽濃度為50 mmol·L-1時，3個居群的MDA含量與對照相比均無顯著差異；當鹽濃度為100 mmol·L-1及以上時，YX和QS居群MDA含量均顯著高于對照(P<0.05)，其中QS居群在處理間差異均達顯著水平(P<0.05)，而HY居群在鹽濃度為200 mmol·L-1及以上時，MDA含量顯著高于對照且處理間差異顯著(P<0.05)；當鹽濃度為300 mmol·L-1時，QS居群、YX居群、HY居群的MDA含量分別是對照的4.0倍、3.4倍和2.2倍。鹽濃度為0～50 mmol·L-1時，3個居群間MDA含量差異不顯著；當鹽濃度為100 mmol·L-1時，QS居群MDA含量顯著高于YX居群和HY居群(P<0.05)，后二者之間差異不顯著；其它濃度處理時，3個居群間MDA含量差異顯著(P<0.05)，且均表現(xiàn)為QS居群>YX居群>HY居群。

圖4 NaCl脅迫下3個居群草地早熟禾MDA含量Fig. 4 MDA contents of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.5 NaCl脅迫對野生草地早熟禾Pro含量的影響

從圖5可以看出，隨著NaCl脅迫濃度的升高，3個居群野生草地早熟禾的Pro含量均呈上升趨勢。在鹽濃度為50 mmol·L-1時，3個居群Pro含量與對照相比無顯著差異；當脅迫濃度為100 mmol·L-1及以上時，各居群Pro含量均顯著高于對照(P<0.05)；當鹽濃度為300 mmol·L-1時，HY居群、YX居群和QS居群的Pro含量分別比對照增加了122.5%、118.8%和113.5%。在NaCl濃度為0～150 mmol·L-1時，HY居群Pro含量顯著高于YX居群和QS居群(P<0.05)，后二者間差異不顯著；在NaCl濃度為200～300 mmol·L-1時，3個居群的Pro含量表現(xiàn)為HY居群>YX居群>QS居群，居群間差異均顯著(P<0.05)。

圖5 NaCl脅迫下3個居群草地早熟禾Pro含量Fig.5 Proline contents of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.6 NaCl脅迫對野生草地早熟禾SS含量的影響

從圖6可以看出，隨NaCl脅迫濃度的升高，YX居群和QS居群野生草地早熟禾SS含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，均于NaCl濃度為250 mmol·L-1時達到最高，而HY居群則呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢；各居群受鹽脅迫后的SS含量均顯著高于對照(P<0.05)；當鹽濃度為0～250 mmol·L-1時，3個居群間SS含量差異均不顯著，但當鹽濃度為300 mmol·L-1時，HY居群SS含量顯著高于YX和QS居群(P<0.05)，但后二者間差異不顯著。

圖6 NaCl脅迫下3個居群野生草地早熟禾SS含量Fig.6 Soluble sugar contents of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.7 NaCl脅迫對野生草地早熟禾SP含量的影響

從圖7可以看出，隨NaCl脅迫濃度的升高，3個居群野生草地早熟禾的SP含量均呈降低趨勢。當鹽濃度為100 mmol·L-1或更高時，3個居群SP含量均顯著低于對照(P<0.05)；當鹽濃度為300 mmol·L-1時，QS居群、YX居群、HY居群的SP含量分別較對照下降55.3%、46.27%和35.65%。當鹽濃度為0～100 mmol·L-1時，3個居群間SP含量均無顯著差異；當鹽濃度為200 ～300 mmol·L-1時，3個居群間的SP含量差異均顯著(P<0.05)。

圖7 NaCl脅迫下3個居群野生草地早熟禾SP含量Fig.7 Soluble protein contents of three wild Poa pratensis accessories under NaCl stress

2.8 NaCl脅迫對野生草地早熟禾光合參數(shù)的影響

由圖8可知，隨著NaCl濃度的升高，3個野生草地早熟禾居群的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)均呈下降趨勢，胞間CO2濃度(Ci)均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，NaCl濃度為150 mmol·L-1時最低。當鹽濃度為300 mmol·L-1時，QS、YX、HY居群的Pn值較對照分別下降52.62%,47.02%和40.0%，Gs值較對照分別下降44.5%,40.9%和29.9%；Tr較對照分別下降46.77%,43.70%,39.73%。

圖8 NaCl脅迫下3個居群草地早熟禾凈光合速率Fig.8 Net photosynthesis rate of three wild Poa pratensis under NaCl stress

圖9 NaCl脅迫下3個居群野生草地早熟禾蒸騰速率Fig.9 Transpiration rate of three wild Poa pratensis under NaCl stress

圖10 NaCl脅迫下3個居群野生草地早熟禾氣孔導度Fig.10 Stomatal conductance of three wild Poa pratensis under NaCl stress

圖11 NaCl脅迫下3個居群野生草地早熟禾胞間CO2濃度Fig.11 Intercelluar CO2 concentrations of three wild Poa pratensis under NaCl stress

2.9 不同居群野生草地早熟禾耐鹽性綜合評價

采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對3個居群7個耐鹽相關指標的隸屬度值進行計算，以各指標隸屬度平均值作為耐鹽性的綜合評價指標，數(shù)值越大表明其耐鹽性越強。結果(表1)表明，3個居群的耐鹽性強弱排序為：HY居群>YX居群>QS居群。

3 討論

草坪草在鹽脅迫時生長受到抑制，葉色發(fā)黃、萎蔫、甚至死亡，極大地影響其景觀效果。同時，其體內(nèi)的一些生理指標也會發(fā)生改變，如膜透性增加、光合能力下降等。

表1 3個居群野生草地早熟禾耐鹽隸屬函數(shù)值Table 1 Subordinate function value of salt tolerance for three wild Poa pratensis accessories

葉片相對含水量是反映植物組織中吸水量與失水量的動態(tài)指標，是植物細胞正常生理活動的基礎，逆境中植物葉片相對含水量的大小，可以反映植物的抗逆性[33]。相關研究[34-35]表明，在鹽脅迫處理后，葉片相對含水量下降緩慢且下降幅度小的植物耐鹽性強。本試驗中，300 mmol·L-1的NaCl處理下，各居群草地早熟禾葉片相對含水量較對照的下降幅度表現(xiàn)為：QS居群>YX居群>HY居群，說明從相對含水量的變化角度分析其耐鹽性大小為HY居群>YX居群>QS居群。

鹽脅迫會造成植物膜透性增強和膜脂過氧化，導致細胞膜系統(tǒng)損傷，膜的完整性被破壞，MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，質(zhì)膜透性與MDA含量反映細胞膜受損傷的程度[36-38]。本試驗中，各材料隨著鹽濃度的升高，質(zhì)膜相對透性和MDA含量均呈現(xiàn)上升趨勢，50 mmol·L-1NaCl脅迫下，與對照差異不顯著，說明此濃度對野生草地早熟禾居群的質(zhì)膜系統(tǒng)影響不明顯；當NaCl濃度為200～300 mmol·L-1時，所有材料的質(zhì)膜相對透性和MDA含量均迅速升高，且顯著高于對照。由上，受NaCl脅迫的植株質(zhì)膜透性顯著增大和顯著高于對照時的初始濃度在不同居群表現(xiàn)出差異，其中HY居群的質(zhì)膜相對透性和MDA含量上升較為平緩，說明HY居群對NaCl脅迫的抵御能力較強。

相關研究表明[39-40]，在一定鹽濃度范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的增加,植物體內(nèi)保護酶活性呈現(xiàn)升高趨勢，但當鹽濃度超過一定范圍時，植物體內(nèi)積累的活性氧超出保護酶清除范圍，植物不能正常生長甚至死亡。本試驗中，0～300 mmol·L-1NaCl脅迫范圍內(nèi)，QS和YX 2個居群的SOD活性先升高后降低，HY居群的SOD活性則始終增強，初步推斷HY居群的耐鹽閾值較高。試驗充分說明在一定鹽脅迫范圍內(nèi)，草坪草可對脅迫產(chǎn)生一定的適應性反應，表現(xiàn)為酶活性增強，但當脅迫強度過大，超過植物的耐受閾值，植物就會崩解甚至死亡。這與梁慧敏[41]對草地早熟禾和黑麥草研究得出的SOD活性在中等鹽濃度時達到最大值，但隨著鹽濃度的增大酶活性又下降的結果一致。

在逆境條件下，植物會迅速積累一些無機離子或合成一些有機物進行滲透調(diào)節(jié)，增強植物的抵抗能力。其中，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物組織中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，降低因滲透失水引起的質(zhì)膜、蛋白質(zhì)以及一些功能的傷害。相關研究表明[12,41-42]，判斷植株耐鹽能力的強弱，應以脯氨酸在脅迫前后的變化幅度來鑒定[43]。從本試驗結果看出，在脅迫范圍內(nèi)，脯氨酸含量隨鹽濃度的增加呈升高趨勢，不同居群脯氨酸的增加幅度不同，脅迫前后HY居群的變化幅度最大，QS居群最小，表明HY居群對NaCl的耐受能力較強。有研究指出[44]，植物組織中積累的可溶性糖含量與植物的抗逆性呈正相關。本試驗中，YX、QS 2個居群的草坪草可溶性糖含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，鹽濃度升高到250 mmol·L-1時的可溶性糖含量均最高，300 mmol·L-1NaCl處理下，組織內(nèi)含糖量降低，分析可能的原因是高濃度鹽脅迫影響植物的正常生長代謝，植物自身合成糖量減少，致使組織內(nèi)可溶性糖含量降低；HY居群可溶性糖隨NaCl濃度升高而升高，可能是HY居群在脅迫范圍內(nèi)組織中糖類的合成正常，且糖的利用量降低的原因所致。李艷波[45]、梁敏[46]等研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫會抑制可溶性蛋白質(zhì)的合成。本試驗中，3個居群的可溶性蛋白均隨鹽濃度的升高而降低，降幅由大到小依次為QS居群、YX居群、HY居群，降幅較大的居群耐鹽性弱。

鹽脅迫會影響植物的光合作用，導致光合參數(shù)發(fā)生變化。有關研究表明[47-50]，高濃度的NaCl脅迫使草坪草的Pn、Gs、Tr顯著降低，不同的草坪品種下降幅度有差異。本試驗得出，3個不同居群野生草地早熟禾在鹽脅迫處理后，其葉片的Pn、Gs、Tr均隨脅迫濃度的升高呈降低趨勢，且下降幅度表現(xiàn)一致，均為QS居群>YX居群>HY居群。有研究指出[51]，耐鹽性強的品種光合作用受抑制的程度比耐鹽性弱的品種小，它具有更好的保護光合結構的能力。HY居群在NaCl脅迫下，能保持相對較高的光合速率、氣孔導度和蒸騰速率，表明HY居群比其它2個居群可能具有更好的自我保護能力，相對受鹽害的影響較小。本試驗結果與孫國榮[52]關于星星草的研究結果一致。

Dunn和Neales[53]的相關研究表明，如果脅迫處理致使植物葉片Gs降低同時Ci濃度也降低，這時氣孔限制是影響植物光合作用的主要因素。如果Gs降低，但植物組織內(nèi)的Ci濃度升高或不變，這時影響植物光合作用的主要因素是非氣孔限制，即可能受酶活性影響[54]。本試驗中，NaCl脅迫濃度0～150 mmol·L-1時，葉片氣孔收縮，Gs降低，但葉肉細胞仍進行光合作用，光合作用的光反應階段消耗了組織內(nèi)的二氧化碳，導致Ci降低，說明此時氣孔因素是影響光合作用的主要因素；NaCl脅迫濃度200～300 mmol·L-1時，植物的光合組織被破壞，光合作用減弱，二氧化碳利用減少，導致Ci升高，3個居群的Ci均較對照高，而Pn和Gs低于對照，說明此時主要是非氣孔因素影響光合作用。本試驗結果與Khavarinejad和Chaparzadeh[55]的結果一致。

4 結論

通過對NaCl脅迫下3個居群的相對含水量、質(zhì)膜透性、MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、SOD以及Pn、Gs、Tr、Ci等參數(shù)的分析，可以較全面地評析3個野生草地早熟禾居群的耐鹽性。采用隸屬函數(shù)法綜合分析得出3個居群耐鹽性依次為HY居群>YX居群>QS居群。已有的研究[56-57]表明，草地早熟禾栽培種的耐鹽閾值為150～200 mmol·L-1，對比發(fā)現(xiàn)，山西3個居群野生草地早熟禾的耐鹽性均高于栽培品種。因此在鹽漬地建植草坪時，經(jīng)引種馴化后坪觀質(zhì)量好的野生草地早熟禾將是最佳的草種選擇之一。