李志華 付京花 唐雪蓮 侯夢杰 吳海斌 潘 慶

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642)

近年來，營養(yǎng)素被用作免疫增強劑以防治疾病的發(fā)生和降低疾病感染［1］。維生素E是水產(chǎn)動物飼料中最重要的營養(yǎng)素之一，特別是在高密度的養(yǎng)殖條件下顯得尤為重要。維生素E與水產(chǎn)動物機體的新陳代謝、抗氧化能力、免疫功能、繁殖性能都有著密切的關系。它通過提高機體內(nèi)抗氧化酶的活性、抑制自由基的形成、加快受損脫氧核糖核酸的清除等途徑減輕自由基對細胞膜中多不飽和脂肪酸、富含巰基的蛋白質(zhì)及細胞骨架和核酸的損傷［2－3］，從而使得水產(chǎn)動物保持正常的生理狀況。已有的研究發(fā)現(xiàn)，維生素E能促進鯉魚(Cyprinus carpio)［4］、大菱鲆(Scophthalmus maximus)［5］的生長，高于 NRC(2011)推薦量的高水平維生素E能顯著提高斑點叉尾(Ictalurus punctatus)［6］、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)［7］的生長性能，并提高其體內(nèi)抗氧化酶的活性。但過高水平維生素E會降低許氏平的生長速度和血色素濃度［8］。過量的維生素E導致香魚紅細胞脆性增強，并且促進體內(nèi)的脂肪過氧化［9］。這些研究結(jié)果提示，過量的維生素E可能對魚類具有毒性作用。本研究旨在運用營養(yǎng)學和毒理學的方法，對維生素E作為抗氧化飼料添加劑的有效性和羅非魚對其的耐受性進行評價，獲得其最大未觀察到有害作用劑量(no observed adverse effect level，NOAEL)，以確定維生素E發(fā)揮最佳功效并不致對機體產(chǎn)生副作用的最大劑量，從而為羅非魚飼料中合理有效地應用維生素E的抗氧化性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚和維生素E

試驗用吉富羅非魚幼魚購于廣州番禺國家羅非魚良種場。試驗用維生素E購自Sigma公司，活性成分為α－生育酚，為微黃綠色黏稠液體，維生素E含量≥96%。

1.2 試驗設計

試驗選用400尾大小均勻［平均體重為(3.25 ±0.02)g］、健康的吉富羅非魚幼魚，隨機分為5組，每組4個重復，每個重復20尾。5組(G0、G1、G2、G3、G4)試驗飼料維生素 E 添加量分別為0(對照)、25、50、250、2 500 mg/kg，測得維生素 E 實際含量分別為 8.5、33.0、56.0、220.0、2 580.0 mg/kg，試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。有效劑量50 mg/kg依據(jù)NRC(2011)和相關文獻推薦的羅非魚對維生素 E 的需要量［7，10－11］確定，最高劑量為有效劑量的50倍。劑量設計原則依據(jù)農(nóng)業(yè)部《飼料和飼料添加劑水產(chǎn)靶動物有效性和耐受性評價試驗指南》和歐盟 EFSA［12］標準。飼料原料經(jīng)粉碎后過60目篩，于攪拌機中混勻30 min，邊攪拌邊緩慢加入豆油和魚油，然后再加入30%的水，最后用雙螺旋擠壓機擠壓成直徑1.5 mm的面條狀，再制成粒狀飼料，自然風干后，保存于－20℃的冰柜中備用。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在室內(nèi)循環(huán)過濾水族箱(68 cm×48 cm×42 cm，容積約130 L)中進行，試驗魚暫養(yǎng)14 d，期間投喂G0組飼料。馴化結(jié)束后，將試驗魚(初始體重約為3.25 g)隨機分配到20個水族箱中，每箱20尾，每天定時定量投喂飼料2次，前4周投飼率為體重的4%，后4周投飼率為體重的5%。水源為曝氣自來水。試驗期間水溫為(26.6± 1.2)℃，pH 7.40 ～ 7.80，溶 解 氧 ＞5.0 mg/L，氨氮 ＜0.3 mg/L。每天定時吸污、換水，換水量為水族箱的1/3。試驗期56 d。

1.4 樣品采集

生長試驗結(jié)束后，禁食24 h進行稱重，然后分別采集羅非魚的肝臟與血清。每箱隨機選取6尾規(guī)格一致的試驗魚，丁香酚麻醉后解剖取肝胰臟，液氮速凍，－80℃保存。另從每箱中取8尾，尾靜脈取血，在3 h內(nèi)完成取血，將血液靜置3 h，以5 400 r/min離心15 min，取血清，－80℃保存，用于抗氧化指標的測定。將保存于－80℃的組織樣品在冰上解凍，取組織塊約1 g在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，放入勻漿玻璃管中，按1 g樣品10 mL的比例加入0.68%冰凍生理鹽水，用玻璃勻漿機1.1×104r/min勻漿2次，每次 30 s，后將組織勻漿液在 4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液，－80℃保存。

1.5 計算與分析

1.5.1 生長性能指標計算

1.5.2 飼料營養(yǎng)成分分析

飼料水分含量采用105℃烘箱干燥法(GB/T 6435—1986)測定;粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定;粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)測定;粗灰分含量采用550℃灼燒法(GB/T 6438—1992)測定;維生素E含量采用高效液相色譜法(JY/T 024—1996)測定。

1.5.3 生化指標分析

采用羥胺法、鉬酸銨法、比色法及芬頓(Fenton)反應測定羅非魚肝胰臟與血清超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)、羥自由基(·OH)含量，所有指標均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測，相應操作參照說明書進行。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行one-way ANOVA方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果用平均值±標準差表示，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素E對羅非魚幼魚生長性能的影響

由表2可見，G4組羅非魚幼魚增重率、特定生長率均低于其他各組，并與G1、G3組達到顯著水平(P＜0.05)，表現(xiàn)出一定的毒性效應。在其他組中，隨著維生素E添加量的提高，增重率、特定生長率呈上升趨勢。G3組羅非魚幼魚增重率、特定生長率顯著高于其他4組(P＜0.05)。除G3組外，各組的飼料效率差異不顯著(P＞0.05)。與G0組相比，各組的存活率都得到提高，其中G2、G4組顯著高于 G0組(P＜0.05)，而其他各組之間差異不顯著(P＞0.05)。一定劑量的維生素E能夠顯著提高羅非魚幼魚的攝食及生長，當添加量達到最適攝入量的50倍時，可能會在一定程度上抑制其生長。

2.2 維生素E對羅非魚幼魚抗氧化酶活性的影響

由表3可見，血清和肝胰臟中的SOD活性均隨著飼料中維生素E添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，G4組羅非魚幼魚的SOD活性出現(xiàn)大幅下降。在血清中，G4組SOD活性顯著低于G2、G3組(P＜0.05)，與 G0、G1組差異不顯著(P ＞0.05)。在肝胰臟中，G4組SOD活性顯著低于G2組(P＜0.05)，與其他3組差異不顯著(P＞0.05)。血清CAT活性也隨飼料中維生素E添加量增加呈先升高后降低的趨勢，以G2組最高;G4組顯著低于 G2組(P＜0.05)，顯著高于 G0、G1組(P ＜0.05)，與 G3組差異不顯著(P ＞0.05)。肝胰臟CAT活性也以G2組最高，G4組顯著低于G2組(P＜0.05)，與其他3組差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 維生素E對羅非魚幼魚生化指標的影響

由表4可見，飼料不同的維生素E添加量對羅非魚肝胰臟維生素E含量產(chǎn)生了一定的影響，表現(xiàn)為 G2、G3、G4組顯著高于 G0、G1組(P＜0.05)，而G0與G1組差異不顯著(P＞0.05)。血清和肝胰臟的MDA含量均隨維生素E添加量的增加而下降，G3和G4組顯著低于G0和G1組(P＜0.05)。除了G1組，血清羥自由基含量在其他4組間差異不顯著(P＞0.05)。肝胰臟羥自由基含量以 G4組最低，顯著低于 G0、G1、G2組(P ＜0.05)，與 G3組差異不顯著(P ＞0.05)。

表2 維生素E對羅非魚幼魚生長性能的影響Table 2 Effects of dietary vitamin E on growth performance of juvenile tilapia

表3 維生素E對羅非魚幼魚血清和肝胰臟中SOD、CAT活性的影響Table 3 Effects of dietary vitamin E on activities of SOD and CAT in serum and hepatopancreas of juvenile tilapia

表4 維生素E對羅非魚幼魚血清和肝胰臟中丙二醛、羥自由基和維生素E含量的影響Table 4 Effects of dietary vitamin E on contents of MDA，·OH and vitamin E in serum and hepatopancreas of juvenile tilapia

3 討論

3.1 飼料中維生素E的適宜添加水平

目前大多數(shù)試驗中所確定的維生素E需求量是指試驗期內(nèi)魚類不出現(xiàn)缺乏癥狀的最低需求量，只有少數(shù)試驗是采用最佳生長或最佳免疫狀態(tài)時維生素 E的適宜需求量［13－15］。越來越多的研究表明，高于最低需求量數(shù)倍的維生素E對水生動物具有促生長和提高免疫力的作用。南亞野鯪攝食150 mg/kg維生素E(5倍NRC需求量)時，其增重率達到最大值［13］。幼建鯉攝食1 500 mg/kg維生素E(15倍 NRC需求量)時，其增重率、白細胞吞噬率分別達到最大值［16］。Paul等［14］給幼印鯪投喂5個添加水平維生素E的飼料12周后，用折線法確定其最佳增重率所需維生素E水平為99 mg/kg(4倍NRC需求量)。

然而魚體對維生素E的營養(yǎng)需求存在一個適宜的劑量范圍，在這個范圍內(nèi)維生素E具有營養(yǎng)作用，而在這個范圍之外可能會引起生長抑制、缺乏或中毒。因為維生素E是脂溶性維生素，與水溶性維生素不同，動物攝入過量的脂溶性維生素，不能在短時間內(nèi)代謝并排出體外，會在體內(nèi)積累，對機體產(chǎn)生毒害作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗進行8周后，G0組的成活率低于其他各組，維生素E添加量最高的G4組則出現(xiàn)增重率、特定生長率低于其他組的現(xiàn)象，生長性能表現(xiàn)最好的為G3組。這與周顯青等［18］、張瓊［16］研究結(jié)果相似。維生素 E缺乏固然會使魚類生長緩慢，但同時維生素E過量也不利于魚類的生長，并可能對魚體有毒害作用，因此需要研究魚類對維生素E的最適需要量。

3.2 維生素E對羅非魚幼魚抗氧酶活性的影響

SOD、CAT是生物體內(nèi)2種十分重要的具有抗氧化作用的酶，是生物體抗氧化防御系統(tǒng)中的重要成員。SOD是一種金屬酶(輔基為金屬離子)，能有效地清除超氧陰離子自由基，以保護機體細胞免受攻擊，而CAT能將SOD清除活性氧時產(chǎn)生的過氧化氫(H2O2)轉(zhuǎn)化為水(H2O)，保護機體細胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細胞的正常生活。大量研究表明，維生素E能夠提高抗氧化酶的活性［19－21］。本試驗結(jié)果與前人一致，與G0組相比，G2、G3組羅非魚幼魚血清和肝胰臟中SOD與CAT活性得到顯著提高。但是當維生素E添加量達到2 500 mg/kg時，機體的抗氧化狀態(tài)在大劑量維生素E作用下出現(xiàn)了變化，與G2、G3組相比，血清和肝胰臟的SOD、CAT活性均明顯下降。

因此，我們認為低劑量的維生素E具有誘導產(chǎn)生抗氧化酶的能力，而過大劑量的維生素E則會抑制抗氧化酶的活性。Andersen［22］對大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，當過大劑量維生素E作用于大鼠時，骨髓中的不成熟細胞膜的脂質(zhì)過氧化水平會減少，這個情況使得某些抗氧化酶在未成熟細胞中表達下降，進而導致抗氧化酶活性下降。至于在魚類中，維生素E與抗氧化酶是否也存在相似的劑量效應則需要進一步的探討，特別是分子水平上的研究。

3.3 飼料中維生素E對脂質(zhì)過氧化及肝胰臟維生素E含量的影響

本研究中，飼料中的維生素E添加量顯著影響魚體肝胰臟中的維生素E含量，隨著飼料中維生素E添加量的增加，羅非魚幼魚肝胰臟中維生素E含量也相應增加。這與張永明等［23］對大鼠，Bai等［24］對許氏平，周顯青等［18］對中華鱉幼鱉的研究是一致的。肝胰臟是機體最重要的器官之一，被稱為機體內(nèi)部的“加工廠”，對機體自身的解毒功能和代謝功能起至關重要的作用。有研究表明，飼料中過大劑量的添加劑會對機體造成損傷，而這種損傷往往會首先表現(xiàn)在肝胰臟組織結(jié)構上［25－26］。由于樣品處理不當，本試驗并沒有做出羅非魚肝胰臟組織橫切圖。

維生素E是最有效的生物抗氧化劑之一，能夠與自由基反應，中斷脂質(zhì)過氧化鏈式反應的進行，因而組織中較高的維生素E含量往往能夠有效阻止組織中的脂質(zhì)過氧化反應［27］。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著維生素E添加量的增加，羅非魚幼魚肝胰臟中維生素E含量逐漸升高，羥自由基的含量逐漸下降。這說明羅非魚肝胰臟所承受的抗氧化壓力有所減輕。MDA是多不飽和脂肪酸氧化降解的主要產(chǎn)物之一。因而MDA可以用來反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度及間接反映細胞損傷的程度，并且MDA也是評價維生素E在抑制組織脂質(zhì)過氧化有效性的一個指標［28－29］。本試驗結(jié)果顯示，飼料中維生素E添加量升高可以使得魚體中MDA含量顯著降低，提示飼料中添加維生素E能夠有效抑制脂質(zhì)過氧化，從而減輕脂質(zhì)過氧化對細胞的損傷。蔡中華等［20］對幼鯉，彭士明［30］對黑鯛的研究中均發(fā)現(xiàn)，飼料中添加維生素E均可顯著降低組織中MDA含量。但 Kaewsrithong等［9］在對香魚的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中較多的維生素E反而會加強香魚機體脂質(zhì)過氧化的程度。原因可能是維生素E與MDA間存在某種劑量效應關系，過大劑量維生素E具有促氧化性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些維生素E在從機體分離出的低密度脂蛋白(LDL)中存在抗氧化劑性質(zhì)［31］，維生素E自由基與LDL的多不飽和脂肪酸的化學反應是這種抗氧化性質(zhì)產(chǎn)生的原因。維生素E對脂質(zhì)過氧化的調(diào)節(jié)作用，特別是其中具體的作用機制需要進一步的研究。

綜合羅非魚幼魚的生長與生理情況，本試驗中維生素E對羅非魚幼魚的最大未觀察到有害作用劑量組為250 mg/kg組，即維生素E日攝入量8.50 mg/kg，故維生素E對羅非魚幼魚56 d的最大未觀察到有害作用劑量值為8.50 mg/(kg·d)。

4 結(jié)論

①飼料中添加50～250 mg/kg維生素E對羅非魚幼魚具有促進生長的作用，但添加量達到2 500 mg/kg時，羅非魚幼魚出現(xiàn)輕微的生長抑制癥狀。

②高于需求量數(shù)倍的維生素E能夠增強羅非魚幼魚的抗氧化酶活性。過大劑量維生素E雖然可以減輕魚體的脂質(zhì)過氧化反應，但會抑制抗氧化酶活性，顯示一定的毒性效應。

③本試驗中維生素E對羅非魚幼魚的最大未觀察到有害作用劑量為8.50 mg/(kg·d)。

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