章 麗， 龔一富， 劉曉丹， 潘益芳， 劉增美， 朱天藝

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)是一種耐鹽能力極強(qiáng)的單細(xì)胞綠藻，其體內(nèi)能合成并積累具有強(qiáng)抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物——β-胡蘿卜素，是研究β-胡蘿卜素積累的一種模式生物。目前國內(nèi)外大量研究都集中在培養(yǎng)條件對鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素積累的影響，特別是光照、溫度、缺氮等培養(yǎng)條件能顯著影響β-胡蘿卜素的合成和積累[1-3]，而對其它誘導(dǎo)因子對β-胡蘿卜素積累報(bào)道較少[4]，朱穎等報(bào)道添加茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)等外源誘導(dǎo)子也可提高鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的含量[4]。MeJA是近年來研究極為熱門的一類芳香類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，是茉莉酸類物質(zhì)的代表，MeJA廣泛存在于高等植物體內(nèi)，對植物的生長發(fā)育、抵抗逆境脅迫(抗鹽、抗旱、抗寒等)、抗病和次生代謝產(chǎn)物積累等方面具有十分重要的作用[5-8]，特別是MeJA對植物次生代謝產(chǎn)物的積累和誘導(dǎo)作用研究是目前研究的熱點(diǎn)，MeJA已廣泛應(yīng)用于陸地上植物的次生代謝產(chǎn)物的積累研究和應(yīng)用中。MeJA促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物積累的機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)防御反應(yīng)或次生代謝合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來提高紫杉醇、長春花堿、銀杏內(nèi)酯、類胡蘿卜素等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累[8-13]，但系統(tǒng)研究MeJA在誘導(dǎo)次生代謝物質(zhì)積累過程中的光合特性、保護(hù)酶活性等生理生化機(jī)理方面的報(bào)道較少。因此，本研究以鹽生杜氏藻為材料，研究不同濃度MeJA脅迫處理對鹽生杜氏藻 β-胡蘿卜素含量、葉綠素含量、POD活性、SOD活性的影響，探討MeJA脅迫下鹽生杜氏藻的生理生化效應(yīng)，為今后進(jìn)一步深入開展β-胡蘿卜素合成調(diào)控和提高β-胡蘿卜素含量研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鹽生杜氏藻(DunaliellaSalina)藻種由寧波大學(xué)海洋工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微藻室提供，用PKS培養(yǎng)基(pH值7.5)培養(yǎng)并保存。鹽藻可在20～320 g/L的NaCl培養(yǎng)液中生存，當(dāng)NaCl濃度為60～120 g/L時(shí)生長較快，因此本實(shí)驗(yàn)采取100 g/L NaCl條件下培養(yǎng)，接種初始密度為105個(gè)/mL。鹽藻培養(yǎng)溫度為25℃±0.5℃，明暗周期比12 h∶12 h，光照強(qiáng)度為4000 lx，靜置培養(yǎng)。

1.2 MeJA處理及取樣

接種初始密度為105個(gè)/mL的對數(shù)生長期鹽生杜氏藻細(xì)胞到新鮮的PKS液體培養(yǎng)基上光照靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后，分別向培養(yǎng)瓶中添加不同體積的MeJA母液，使培養(yǎng)瓶中MeJA終濃度分別為0、50、100、200和500 μmol/L，每個(gè)外源MeJA脅迫組設(shè)3個(gè)重復(fù)組。MeJA脅迫處理后每2 d取各處理組樣品20 mL，4000 r/min離心20 min，棄上清，將沉淀保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)測定鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素和葉綠素的含量。MeJA脅迫處理后0、6、12、24、48和72 h分別取樣，離心保存于-20℃冰箱，用于測定鹽生杜氏藻POD酶活性和SOD酶活性。

1.3 β-胡蘿卜素和葉綠素含量的測定

從冰箱中取出鹽生杜氏藻各處理組樣品，加入適量95%乙醇溶液提取β-胡蘿卜素和葉綠素，離心取上清，沉淀用95%乙醇再重復(fù)提取2次，合并各次提取液，定容到25 mL容量瓶中，在722型分光光度計(jì)上測定450 nm、649 nm和665 nm處的光吸收值，即OD450、OD649和OD665。

根據(jù)Jensen公式換算出鹽生杜氏藻藻液中的β-胡蘿卜素及葉綠素的含量[10]。β-胡蘿卜素含量(mg/L) =OD450× 提取液的體積(mL) × 稀釋倍數(shù) × 103/2500。葉綠素濃度(mg/L) = 葉綠素a濃度 + 葉綠素b濃度。葉綠素a濃度(mg/L) = 11.98OD665-1.93OD649；葉綠素b濃度(mg/L) = 20.36OD649-5.50OD665，單位鮮重葉綠素含量(mg/g FW)= [葉綠素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重。

1.4 POD和SOD酶活性的測定

POD酶活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[14]，SOD酶活性的測定采用NBT光還原法[14]。然后計(jì)算相對酶活=實(shí)驗(yàn)組酶活/對照組酶活。

1. 5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel軟件統(tǒng)計(jì)、處理；并用SPSS16.0軟件在對照組和實(shí)驗(yàn)處理組之間進(jìn)行差異顯著性分析以及處理組之間單因素方差分析，認(rèn)為P<0.01時(shí)存在極顯著性差異，P<0.05時(shí)存在顯著性差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量的影響

研究外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻細(xì)胞β-胡蘿卜素含量的影響，結(jié)果表明(圖1)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，不添加MeJA組(對照組)和添加100 μmol/L MeJA組(處理組)的鹽生杜氏藻細(xì)胞β-胡蘿卜素含量均呈逐漸增加的趨勢，其β-胡蘿卜素積累曲線呈典型的S型曲線，在培養(yǎng)第4～8 d時(shí)，β-胡蘿卜素積累處于對數(shù)增長期，而培養(yǎng)第10 d后，β-胡蘿卜素積累變化不明顯，處于積累平臺期。比較外源MeJA處理組和對照組鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量的變化，結(jié)果表明，100 μmol/L 外源MeJA處理組的β-胡蘿卜素含量均明顯高于未處理對照組(P<0.01)，說明MeJA可顯著促進(jìn)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的積累。研究不同濃度外源MeJA脅迫處理對鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量的影響，結(jié)果表明(圖1)，隨著MeJA濃度的升高，鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)MeJA濃度為100 μmol/L時(shí)，鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量最高。

圖1 外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量的影響

圖2 外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻葉綠素含量的影響

2.2 外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻光合生理指標(biāo)的影響

葉綠素含量代表光合作用水平，外源MeJA脅迫處理是否會對鹽生杜氏藻光合作用造成影響。本研究通過研究外源MeJA脅迫處理對鹽生杜氏藻細(xì)胞葉綠素含量的影響，結(jié)果表明(圖2)，在培養(yǎng)初期，鹽生杜氏藻葉綠素含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，在培養(yǎng)第8 d時(shí)其葉綠素含量達(dá)最大值，隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，葉綠素含量呈逐漸下降的趨勢，表明鹽生杜氏藻在培養(yǎng)8 d前其光合作用效率逐漸增加，隨著時(shí)間的推移，藻類生長和β-胡蘿卜素含量均達(dá)到平臺期，此時(shí)的光合作用效率也逐漸降低。比較外源MeJA處理組和對照組鹽生杜氏藻葉綠素含量的變化，結(jié)果表明，100 μmol/L 外源MeJA處理組的葉綠素含量均明顯高于未處理對照組(P<0.01)，說明MeJA可顯著促進(jìn)鹽生杜氏藻葉綠素的積累，即可促進(jìn)其光合作用。比較不同濃度外源MeJA脅迫處理對鹽生杜氏藻葉綠素含量的影響，結(jié)果表明(圖2)，隨著外源MeJA脅迫濃度的升高，鹽生杜氏藻葉綠素含量呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)MeJA濃度為100 μmol/L時(shí)，鹽生杜氏藻葉綠素含量最高。

2.3 外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻POD酶活性的影響

研究外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻POD酶活性變化的影響，結(jié)果表明(圖3)，隨著MeJA處理時(shí)間的延長，MeJA處理組POD酶活性呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)MeJA處理時(shí)間為24 h時(shí)，其POD酶活性最大，而未處理對照組在培養(yǎng)過程中POD酶活性無明顯的變化。在外源MeJA處理的72 h內(nèi)，MeJA處理組的POD酶活性均顯著高于未處理組，說明外源MeJA脅迫提高了POD酶的活性。研究不同濃度MeJA在處理24 h時(shí)POD酶活性的變化，結(jié)果表明(圖3)，隨著MeJA處理濃度的增加，鹽生杜氏藻POD酶活性呈先上升后下降的趨勢，其中50 μmol/L MeJA處理時(shí)POD酶活性最大，且各外源MeJA脅迫處理組POD酶活性均明顯高于未處理對照組(P<0.01)，說明MeJA處理使鹽生杜氏藻POD酶活性提高。

圖3 外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻POD酶活性的影響

2.4 外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻SOD酶活性的影響

測定100 μmol/L MeJA處理組和未處理對照組鹽生杜氏藻SOD酶活性變化，結(jié)果表明(圖4)，隨著MeJA處理時(shí)間的延長，處理組SOD酶活性呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)外源MeJA脅迫處理48 h時(shí)，其SOD酶活性達(dá)最大值，而未處理對照組在培養(yǎng)過程中SOD酶活性無顯著變化。比較MeJA處理組和未處理對照組各SOD酶活性表明，MeJA處理組SOD酶活性均顯著高于未處理對照組SOD酶活性，說明MeJA脅迫處理可提高鹽生杜氏藻SOD酶的活性。研究不同濃度MeJA在處理48 h時(shí)SOD酶活性的變化，結(jié)果表明(圖4)，隨著MeJA處理濃度的增加，鹽生杜氏藻SOD酶活性呈逐漸上升的趨勢，且各濃度處理組SOD酶活性均顯著高于未處理對照組，說明MeJA處理使鹽生杜氏藻SOD酶活性提高，其中500 μmol/L MeJA處理時(shí)其SOD酶活性最大，方差分析表明各MeJA處理組SOD酶活性差異顯著。

圖4 外源MeJA脅迫對鹽生杜氏藻SOD酶活性的影響

3 討論

MeJA在植物信號中具有重要作用，外源MeJA可啟動植物防御途徑并誘導(dǎo)防御相關(guān)基因表達(dá)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶抑制因子、防御相關(guān)性化合物[15]。外源MeJA還能夠誘導(dǎo)植物的次級代謝網(wǎng)絡(luò)途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)次生代謝物包括萜類、黃酮類、生物堿類等化合物的大量積累[8]。Gong等研究表明，外源MeJA脅迫處理銀杏愈傷組織，能通過調(diào)控銀杏細(xì)胞中銀杏內(nèi)酯合成途徑中的關(guān)鍵酶dxs基因的表達(dá)來提高銀杏內(nèi)酯的含量[9]。外源MeJA脅迫處理可使整株煙草的煙堿含量提高2～10倍[16]。外源MeJA脅迫處理能明顯提高抗癌藥物紫杉醇和紫杉烷類化合物的含量[11-13]。外源MeJA脅迫處理還可提高大豆異黃酮、雨生紅球藻蝦青素、丹參酚酸類物質(zhì)、黃芪黃酮等次生代謝產(chǎn)物的積累[17-20]。本研究表明，MeJA能誘導(dǎo)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的積累。其中，100 μmol/L的MeJA處理效果最佳，與在紅豆杉中的報(bào)道一致。

外源MeJA能夠誘導(dǎo)β-胡蘿卜素的累積有兩方面原因，一種可能為MeJA可誘導(dǎo)類胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致β-胡蘿卜素的生物積累。Liu等人指出MeJA能夠誘導(dǎo)類胡蘿卜素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的合成，在促進(jìn)番茄紅素生物合成中發(fā)揮著積極的作用[21]。Kim等發(fā)現(xiàn)對生菜噴灑0.5 μM MeJA，其β-胡蘿卜素含量在8 d后變化不顯著，但是對照組相對于MeJA處理組，6 d后β-胡蘿卜素含量只有處理組的31%[22]。

隨著MeJA濃度的升高，8 d后β-胡蘿卜素和葉綠素呈先增高后下降趨勢。唐美玲研究MeJA對蘋果和梨葉片葉綠素的影響表明，MeJA對葉綠素總量的影響趨勢是先降低后升高[31]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與所用不同物種有關(guān)；趙瑾等研究的干旱脅迫下圓柏葉綠素含量變化呈現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象[32]；與鹽生杜氏藻的結(jié)果相似?？赡茉蛴幸环矫媸怯捎诿{迫的氧化損傷加劇，使葉綠素合成受阻，降解加快，因此葉綠素含量下降；活性氧的增加也致使β-胡蘿卜素清除氧自由基的能力受阻，合成減慢。另一方面，高濃度MeJA處理鹽生杜氏藻時(shí)，其生長受到抑制，單位體積內(nèi)藻細(xì)胞數(shù)量明顯下降，導(dǎo)致相同體積藻液的葉綠素和β-胡蘿卜素含量也明顯下降。而POD在不同濃度的MeJA下處理8 h后的變化趨勢則表明鹽生杜氏藻對脅迫反應(yīng)的典型特征，當(dāng)MeJA的濃度較低時(shí)，產(chǎn)生活性氧較少，能激活細(xì)胞內(nèi)POD的活性，藻細(xì)胞抗逆性增強(qiáng)。當(dāng)MeJA濃度升高時(shí)，藻細(xì)胞內(nèi)活性氧的代謝嚴(yán)重失衡，此時(shí)POD對機(jī)體的保護(hù)作用減弱，活性降低。有趣的是藻細(xì)胞中SOD的活性一直呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢。這與其他高等植物在脅迫環(huán)境下SOD的變化趨勢不同，可能是鹽生杜氏藻與高等植物抗氧化防御系統(tǒng)的組成和數(shù)量的不同所造成的，鹽藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的類胡蘿卜素，對SOD可能也具有保護(hù)作用。但鹽藻SOD活性的過高或過低對于β胡蘿卜素的積累都是不利的。鹽生杜氏藻作為最耐鹽的單細(xì)胞藻類，其高SOD活性也是抗逆能力的標(biāo)志。

鹽生杜氏藻對環(huán)境的脅迫和適應(yīng)能力是β-胡蘿卜素積累的基礎(chǔ)和前提。本實(shí)驗(yàn)初步討論了鹽藻對MeJA脅迫的部分生理機(jī)制。說明鹽生杜氏藻對MeJA的反應(yīng)較為敏感，也表明鹽生杜氏藻能對MeJA脅迫做出反應(yīng)，進(jìn)而啟動其相應(yīng)的生理活動或迅速的防御反應(yīng)，抵御活性氧的傷害。

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