羅海華， 周 南， 張 旭， 郭學(xué)敏， 張 輝， 劉 超

(中山大學(xué)人類病毒學(xué)研究所，熱帶病防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510080)

艾滋病和惡性腫瘤是目前威脅人類生命安全的兩大重要疾?。?-2］。將艾滋病患者或腫瘤患者體內(nèi)的CD8+T 細(xì)胞分離出來，體外擴(kuò)增后再輸回患者體內(nèi)進(jìn)行過繼性免疫治療在臨床應(yīng)用的前景非常廣闊，但CD8+效應(yīng)T 細(xì)胞的壽命較短，無法在體內(nèi)維持長(zhǎng)時(shí)間的免疫應(yīng)答。因此，壽命較長(zhǎng)的CD8+記憶T 細(xì)胞正在成為過繼性免疫治療中的主要細(xì)胞，得到越來越多的重視與應(yīng)用。目前，體外擴(kuò)增CD8+記憶T 細(xì)胞的方法主要包括:用白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-15 刺激CD8+記憶T 細(xì)胞的體外擴(kuò)增［3］;用結(jié)合了anti-CD3 抗體和anti-CD28 抗體的磁珠體外擴(kuò)增具有抗原特異性的CD8+記憶T 細(xì)胞［4］;用抗原提呈細(xì)胞體外激活CD8+記憶T 細(xì)胞［5］。

本研究選取了6 種刺激人類CD8+記憶T 細(xì)胞體外擴(kuò)增的刺激物(anti-CD3 抗體、anti-CD28 抗體、CD70、IL-2、IL-7 和IL-15)，并對(duì)其進(jìn)行排列組合，設(shè)計(jì)出了63 種刺激方式，如此大規(guī)模的組合，在同類研究中尚屬首次。通過多次實(shí)驗(yàn)比較，本研究探索出了一種理想的組合方式可有效地體外擴(kuò)增人類CD8+記憶T 細(xì)胞，從而為抗病毒與抗腫瘤的過繼性免疫治療提供了新的手段。

材 料 和 方 法

1 材料

正常人的外周血由廣州市血液中心提供。

2 主要試劑與溶液

抗人CD45RA(isoforms of CD45 containing the A exon，含有外顯子A 的CD45 亞型)抗體-FITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)、抗人CD8抗體-APC(allophycocyanin，別藻藍(lán)蛋白)和抗人CCR7 抗體-PE(phycoerythrin，藻紅蛋白)均購自BD Pharmigen;單克隆抗人CD3ε 抗體、單克隆抗人CD28 抗體、CD70、重組人IL-2、重組人IL-7 和重組人IL-15 均購自RD。人淋巴細(xì)胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所;RPMI -1640 培養(yǎng)基購自Invitrogen;胎牛血清購自Gibco。

PBS 溶液:稱取8 g NaCl、0. 2 g KCl、3. 58 g NaH2PO4·12H2O 和0.24 g KH2PO4，用800 mL 溶解，HCl 調(diào)pH 至7.4，定容至1 000 mL，高壓滅菌，室溫保存。

4%臺(tái)盼藍(lán)母液:稱取4 g 臺(tái)盼藍(lán)，加少量雙蒸水研磨，再加雙蒸水定容至100 mL，過濾，于4 ℃保存，使用時(shí)用PBS 溶液稀釋成0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液。

3 主要儀器

生物安全柜(Thermo Scientific);水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810R);微量移液器(Eppendorf);倒置生物顯微鏡(Leica);血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司);20 mL 注射器(北京頗賽科技發(fā)展有公司);流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson);CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific);電子分析天平(Acculab ALC-210.4);pH 計(jì)(雷磁PHS-25);定時(shí)恒溫磁力攪拌器(雷磁JB-3 型)。

4 主要方法

4.1 細(xì)胞分離 從正常人外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)(準(zhǔn)備2 支20 mL 注射器，5 支50 mL 離心管，分別編號(hào)為1、2、3、4 和5 號(hào);用注射器向1 號(hào)和2 號(hào)離心管中加入25 mL 人淋巴細(xì)胞分離液;用注射器吸取10 mL 正常人外周血，加入到3 號(hào)離心管中，再加入40 mL PBS 溶液，混勻;用吸管向1 號(hào)和2 號(hào)離心管中各加入25 mL 混勻的外周血與PBS 的混合液;20 ℃、2 000 r/min 離心25 min;小心吸出PBMCs，加到4 號(hào)和5 號(hào)離心管中，并加入3 ～5 倍體積的PBS 溶液;20 ℃、300 ×g 離心10 min;棄上清液，再向1 號(hào)和2 號(hào)離心管中加入50 mL PBS 溶液，重懸混勻;20 ℃、300 ×g 離心10 min;棄上清液，用RPMI-1640 培養(yǎng)基定容至10 mL;用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng));隨后，用抗人CD8 抗體-APC 對(duì)PBMCs 進(jìn)行標(biāo)記，并用流式細(xì)胞術(shù)分選出純度達(dá)到99%的CD8+T 細(xì)胞。

4.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將分選出來的CD8+T 細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，均勻鋪于96 孔板中(每孔細(xì)胞數(shù)為1 ×105);將細(xì)胞培養(yǎng)板置于5% CO2、飽和濕度及37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.3 用63 種刺激組合體外擴(kuò)增人類CD8+T 細(xì)胞

將6 種刺激因子進(jìn)行排列組合，得到63 種刺激組合。本實(shí)驗(yàn)所用的6 種刺激因子的濃度分別為:anti-CD3 抗體(1 mg/L)、anti-CD28 抗體(1 mg/L)、CD70(50 μg/L)、IL-2(10 μg/L)、IL-7(10 μg/L)、IL-15(10 μg/L)。將鋪板后的CD8+T 細(xì)胞分成2 組:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組;對(duì)實(shí)驗(yàn)組的CD8+T 細(xì)胞分別施加以上63 種刺激，并在細(xì)胞培養(yǎng)的第4 天、第7 天和第10 天施加同樣方式的刺激;在細(xì)胞培養(yǎng)的第7 天將CD8+T 細(xì)胞從96 孔板轉(zhuǎn)移到24 孔板，并將培養(yǎng)基體積由0.2 mL 擴(kuò)大到1 mL;在細(xì)胞培養(yǎng)的第14 天，用血球計(jì)數(shù)板和臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)每孔的活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并按照公式(1)計(jì)算63 種刺激組合下的CD8+T 細(xì)胞的體外擴(kuò)增倍數(shù);根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選出最有利于CD8+T 細(xì)胞體外擴(kuò)增的6 種刺激方式，進(jìn)行下一步針對(duì)CD8+T 細(xì)胞、CD8+中樞記憶T 細(xì)胞(central memory T cells，TCM)和CD8+效應(yīng)記憶T 細(xì)胞(effector memory T cells，TEM)TEM 的體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

4.4 用優(yōu)選的6 種刺激方式體外擴(kuò)增CD8+T 細(xì)胞、CD8+中樞記憶T 細(xì)胞和CD8+效應(yīng)記憶T 細(xì)胞

從正常人外周血中分離出PBMCs，繼而通過流式細(xì)胞儀從中分選得到純度達(dá)到99% 的CD8+T 細(xì)胞;對(duì)分選出的CD8+T 細(xì)胞進(jìn)行抗體標(biāo)記(抗人CD8 抗體-APC)，隨后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+TCM 和CD8+TEM 在CD8+T 細(xì)胞中所占的比例;將分選出來的CD8+T 細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，均勻鋪在96 孔板中(每孔細(xì)胞數(shù)為1 ×105)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組的CD8+T 細(xì)胞施加優(yōu)選的6 種刺激，在細(xì)胞培養(yǎng)的第14 天，用血球計(jì)數(shù)板和臺(tái)盼藍(lán)染色法，對(duì)每孔的活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù);在對(duì)實(shí)驗(yàn)組中的CD8+T 細(xì)胞進(jìn)行抗體標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+T 細(xì)胞的純度，以及其中TCM 和TEM 所占的比例;用公式(1)、公式(2)和公式(3)分別計(jì)算在6 種優(yōu)化的刺激方式作用下，培養(yǎng)14 d 后的CD8+T 細(xì)胞、CD8+TCM 和CD8+TEM 的體外擴(kuò)增倍數(shù)，進(jìn)而篩選出最為理想的刺激方式。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用最小顯著性差異t 檢驗(yàn)法(LSD-t 檢驗(yàn))。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CD8+ T 細(xì)胞的純度檢測(cè)

從正常人外周血中分離出PBMCs，再用抗人CD8 抗體-APC 對(duì)PBMCs 進(jìn)行標(biāo)記，并用流式細(xì)胞術(shù)分選出純度達(dá)到99%的CD8+T 細(xì)胞，見圖1。

Figure 1. Purity of human CD8 + T cells after sorting.Human PBMCs were isolated and labeled with anti-human CD8-APC antibody and sorted by FACS. Then the purity of human CD8 + T cells after sorting was examined. Three donors were examined and only one was shown.圖1 分選后人類CD8 + T 細(xì)胞的純度

2 63 種刺激方式對(duì)人類CD8+ T 細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響

對(duì)分選出的人類CD8+T 細(xì)胞施加63 種刺激，并培養(yǎng)14 d，最后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。由公式(1)計(jì)算出63 種刺激方式作用下的人類CD8+T 細(xì)胞的體外擴(kuò)增倍數(shù)，見圖2。

結(jié)果表明，有6 種刺激方式使CD8+T 細(xì)胞體外擴(kuò)增的倍數(shù)達(dá)到4 倍以上，它們分別是:anti-CD3 抗體、IL-2 和IL-7 三者的組合;anti-CD3 抗體、IL-2、IL-7 和IL-15 四者的組合;anti-CD3 抗體、anti-CD28 抗體、CD70、IL-7 和IL-15 五者的組合;anti-CD3 抗體、anti-CD28 抗體、IL-2 和IL-7 四者的組合;anti-CD3 抗體、anti-CD28 抗體、IL-2 和IL-15 四者的組合;anti-CD3 抗體、CD70、IL-2 和IL-15 四者的組合。由于如此大規(guī)模的組合對(duì)于抗體與細(xì)胞因子的消耗巨大，因此，受到實(shí)驗(yàn)條件的限制，該輪篩選樣本數(shù)n=1。

3 CD8+ TCM 和CD8+ TEM 純度和所占比例的檢測(cè)

隨機(jī)選取3 份正常人外周血樣術(shù)，從中分離出PBMCs，再分選出純度達(dá)到99%的CD8+T 細(xì)胞。對(duì)分選出的CD8+T 細(xì)胞進(jìn)行抗體標(biāo)記(抗人CD8 抗體-APC、抗人CD45RA 抗體-FITC 和抗人CCR7 抗體-PE)，檢測(cè)其中CD8+TCM 和CD8+TEM 所占的比例，見圖3、表1。結(jié)果表明，3 個(gè)不同個(gè)體外周血中CD8+TCM 和CD8+TEM 所占的比例差異較大，這可能會(huì)導(dǎo)致不同個(gè)體的CD8+記憶T 細(xì)胞對(duì)同等體外刺激的應(yīng)答產(chǎn)生較大的差別。

4 優(yōu)選的6 種刺激方式對(duì)CD8+ TCM 和CD8+TEM 體外擴(kuò)增的影響

將優(yōu)選的6 種刺激方式進(jìn)一步用于體外擴(kuò)增人類CD8+T 細(xì)胞、CD8+TCM 和CD8+TEM，培養(yǎng)14 d后，檢測(cè)CD8+T 細(xì)胞的純度以及其中TCM 和TEM所占的比例，并用血球計(jì)數(shù)板和臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表2。由公式(1)和公式(2)計(jì)算在6 種刺激方式作用下，培養(yǎng)14 d 后CD8+TCM 的體外擴(kuò)增倍數(shù)見圖4。結(jié)果表明，與對(duì)照組(mock)相比，anti-CD3 抗體、IL-2 和IL-7 三者的組合使CD8+TCM 體外擴(kuò)增的倍數(shù)最多(13.28 倍)，2 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

由公式(1)和公式(3)計(jì)算在6 種刺激方式作用下，培養(yǎng)14 d 后的CD8+TEM 的體外擴(kuò)增倍數(shù)見圖5。結(jié)果表明，anti-CD3 抗體、IL-2 和IL-7 三者的組合使CD8+TEM 體外擴(kuò)增倍數(shù)最多(15.27 倍)，與對(duì)照組(mock)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

Figure 2. Effects of 63 kinds of stimulating combinations on human CD8 + T cell expansion in vitro.Six kinds of stimuli (anti-CD3 antibody，anti-CD28 antibody，CD70，IL-2，IL-7 and IL-15)for the expansion of human CD8 + T cells in vitro were selected and arranged for their combinations，resulting in 63 kinds of stimulating combination. Normal human CD8 + T cells were isolated and exposed to a variety of stimuli. After 14 days of cell culture，the numbers of CD8 + T cells were detected.圖2 63 種刺激組合對(duì)人類CD8 + T 細(xì)胞體外擴(kuò)增的效果

Figure 3. Purity of CD8 + T cells and percentages of CD8 + TCM and CD8 + TEM after sorting. A:normal human CD8 + T cells were sorted by FACS and the purity of CD8 + T cells was examined;B:normal human CD8 +T cells were sorted by FACS and the percentages of CD8 + TCM and CD8 + TEM were also detected. Three donors were examined and only one was shown.圖3 分選出的CD8 + T 細(xì)胞的純度以及CD8 + TCM 和CD8 + TEM 所占的比例

表1 分選出的CD8 + T 細(xì)胞的純度以及CD8 + TCM 和CD8 + TEM 所占的比例Table 1. Purity of CD8 +T cells and percentages of CD8 + TCM and CD8 + TEM after sorting (%.Mean±SD.n=3)

表2 培養(yǎng)14 d 后CD8 + T 細(xì)胞的純度以及CD8 + TCM 和CD8 + TEM 所占的比例Table 2. Purity of CD8 + T cells and percentages of CD8 + TCM and CD8 + TEM after 14 days (%.Mean±SD.n=3)

討 論

近年來過繼性免疫治療在臨床上得到越來越廣泛的應(yīng)用。如何更好地實(shí)現(xiàn)T 細(xì)胞的體外擴(kuò)增，是提高過繼性免疫治療療效的一大難點(diǎn)。目前一些研究人員在體外使用人工抗原提呈細(xì)胞，促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖，但仍然存在臨床治療的成本較高且安全性難以保證等問題。在本研究中，我們選取了6 種刺激人類CD8+記憶T 細(xì)胞體外擴(kuò)增的刺激物(anti-CD3 抗體、anti-CD28 抗體、CD70、IL-2、IL-7 和IL-15)，并對(duì)其進(jìn)行排列組合，設(shè)計(jì)出了63 種刺激方式，并優(yōu)選出6種刺激方式進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究表明，在體外培養(yǎng)14 d 的條件下，與對(duì)照組(mock)相比，anti-CD3 抗體、IL-2 和IL-7 三者的組合使CD8+TCM 和CD8+TEM 體外擴(kuò)增的倍數(shù)最多，分別為13.28 倍和15.27 倍。

Figure 4. Effects of 6 kinds of stimulating combinations on human CD8 + TCM cell expansion in vitro. Mean ±SD. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock.圖4 6 種刺激組合對(duì)人類CD8 + TCM 體外擴(kuò)增的影響

Anti-CD3 抗體能夠激活T 細(xì)胞并促進(jìn)其增殖。在T 細(xì)胞被激活后，IL-2 受體α 就會(huì)迅速而大量地上調(diào)，并且T 細(xì)胞可以自分泌IL-2，來促進(jìn)自身的增殖。IL-7 具有促進(jìn)T 細(xì)胞增殖和維持CD8+記憶T細(xì)胞存活的作用，并且能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)。因此，用anti-CD3 抗體、IL-2 和IL-7 三者組合刺激CD8+記憶T 細(xì)胞，可激活其增殖和存活的信號(hào)通路，從而促進(jìn)其體外擴(kuò)增。

Figure 5. Effects of 6 kinds of stimulating combinations on human CD8 + TEM cells expansion in vitro.Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock.圖5 6 種刺激組合對(duì)人類CD8 + TEM 體外擴(kuò)增的影響

CD8+記憶T 細(xì)胞包括CD8+TCM 和CD8+TEM。CD8+TCM 表達(dá)CD62L 和CCR7，主要分布在淋巴組織，能夠迅速增殖分化為CD8+效應(yīng)T 細(xì)胞;CD8+TEM 不表達(dá)CD62L 和CCR7，主要分布在外周組織，能夠?qū)υ俅胃腥井a(chǎn)生迅速的免疫反應(yīng)［6］。因此，體外大量擴(kuò)增CD8+記憶T 細(xì)胞，對(duì)于提高過繼性免疫治療的效果具有重要意義。本研究表明，anti-CD3 抗體、IL-2 和IL-7 三者的組合，是刺激人類CD8+記憶T 細(xì)胞體外擴(kuò)增的理想方法，為抗病毒與抗腫瘤的過繼性免疫治療提供了新的手段。

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