宋春紅， 李 莉， 張永歡， 王蔚琛， 竇橙云， 李瑞峰△

(1石家莊市第四醫(yī)院病理科，河北石家莊050011;2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)研究所，山東濟南250012;3青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院病理科，山東青島266100;4濱州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山東煙臺264003;5山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科，山東 濟南250012)

肝臟是人體最大的能量代謝器官及胰島素敏感組織。糖尿病是復(fù)雜的系統(tǒng)性疾病，以代謝紊亂為顯著特征，可以引起肝臟組織學(xué)、分子生物學(xué)及功能改變。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎中的一種生物堿，具有降血糖、活血化瘀、擴張血管、抗凋亡、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等多種作用［1-2］。氨基胍(aminoguanidine，AG)為一種親核類的肼類化合物，通過抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)的形成和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的活性而被公認(rèn)為干預(yù)糖尿病有效的藥物。本課題組前期研究顯示，聯(lián)合應(yīng)用川芎嗪及氨基胍，無論在降低新生鏈脲佐菌素糖尿病大鼠(neonatal-0 streptozocininduced rats，n0-STZ大鼠)空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)和胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，IRI)方面，還是在降低血漿NO、糖化血紅蛋白水平及外周血白細(xì)胞iNOS表達(dá)方面，均比單用川芎嗪或氨基胍治療效果顯著［3］;且聯(lián)合治療可以通過抑制硝化應(yīng)激而改善n0-STZ大鼠腎臟功能［4］。本研究擬進(jìn)一步觀察川芎嗪與氨基胍聯(lián)合應(yīng)用對n0-STZ大鼠肝臟損害的保護(hù)效果與機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 出生當(dāng)日的Wistar大鼠100只，體重約6 g，山東大學(xué)實驗動物中心提供。動物先由母乳喂養(yǎng)，于4周齡后雌雄分籠喂養(yǎng)，自由攝水?dāng)z食。室內(nèi)溫度控制在(22±3)℃，維持12/12 h的白天/黑夜交替。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自Sigma;氨基胍鹽酸鹽購自上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司;鹽酸川芎嗪購自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司;鹽酸二甲雙胍(metformin，MET)購自北京京豐制藥有限公司;兔抗大鼠caspase-3、Fas及 Bcl-2Ⅰ抗購自武漢博士德公司;兔抗大鼠iNOSⅠ抗由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供;小鼠抗大鼠β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgGⅡ抗及山羊抗小鼠IgGⅡ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;NO和iNOS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光增強顯色試劑盒購自Millipore。

2 方法

2.1 n0-STZ大鼠模型制備及分組 出生當(dāng)日的Wistar大鼠100只，隨機選取80只左下腹消毒，腹腔注射STZ 90 mg/kg，STZ臨用前溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌。其余20只作為正常對照(normal control，NC)組，腹腔注射生理鹽水。正常飼養(yǎng)至8周齡，空腹血糖≥7.0 mmol/L者選入本研究。將胰島素抵抗大鼠隨機分為模型(nodel，MD)組、MET治療組和TMP+AG聯(lián)合治療組，每組20只。MET組每天經(jīng)飲水?dāng)z入二甲雙胍125 mg/kg;TMP+AG組每天經(jīng)飲水?dāng)z入鹽酸川芎嗪50 mg/kg與氨基胍鹽酸鹽25 mg/kg。喂養(yǎng)24周，觀察大鼠一般情況。

2.2 血液生化檢查 32周齡，全部大鼠摘取眼球采血處死，留取血清、血漿。檢測FPG和FINS，IRI根據(jù)公式IRI=(FPG×FINS)/22.5計算。酶學(xué)法檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateamino transferase，AST)水平。

2.3 iNOS活性和NO濃度檢測 10%肝組織勻漿，依次加入試劑充分混勻，490 nm(NO)或530 nm(iNOS)波長測各管吸光度值。

2.4 HE染色 取肝臟組織，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，制作5μm石蠟切片，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 Western blotting檢測肝臟組織中 iNOS、Fas、Bcl-2和caspase-3蛋白的表達(dá) 取組織50 mg，加入細(xì)胞裂解液，經(jīng)機械和超聲勻漿，4℃低溫12 000 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測總蛋白質(zhì)濃度，將各組濃度調(diào)到同一水平，制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到硝酸纖維素濾膜上，5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，加入Ⅰ抗4℃過夜，TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次。通過ECL化學(xué)發(fā)光增強顯色試劑盒進(jìn)行顯色，MF-ChemiBIS儀器成像系統(tǒng)成像，蛋白峰面積灰度分析，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行蛋白半定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。采用Kaplan-Meier法估計生存率，生存率假設(shè)檢驗采用log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 n0-STZ大鼠成模情況

8周齡時，80只大鼠中有 66只 FPG≥7.0 mmol/L，成模率為82.5%，死亡率為0。該組大鼠尿量增多，體重增加，皮毛色黃、缺少光澤，活動量少。

2 各組大鼠生存率比較

32周齡時，NC組存活20只，存活率100%;MD組存活7只，存活率35%;MET組存活14只，存活率70%;TMP+AG組存活17只，存活率85%。MD組和MET組生存率明顯低于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組生存率明顯高于MD組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組組間生存率無顯著差異。

3 各組大鼠FPG、FINS和IRI檢測結(jié)果

32周齡時MD組的FPG明顯高于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組較MD組顯著下降(P＜0.05)，兩干預(yù)組及NC組之間無顯著差異;MD組FINS高于NC組(P＜0.05)，TMP+AG組低于MD組(P＜0.05)，也低于 MET組(P＜0.05)，但高于NC組(P＜0.05)，MET組與MD組之間無顯著差異;對于IRI，MD組明顯高于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組低于MD組(P＜0.05)，TMP+AG組低于MET組(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的觀察Table 1.The levels of FPG，F(xiàn)INSand IRI in the rats(Mean±SD)

4 各組大鼠肝功能檢測結(jié)果

32周齡時，MD組的血清ALT和AST水平較NC組明顯增加(P＜0.01)，與MET組相比，聯(lián)合治療在降低ALT(P＜0.01)和AST(P＜0.01)水平方面作用較強，見表2。

表2 各組大鼠血清ALT與AST水平的變化Table 2.The serum levels of ALT and AST in the rats(U/L.Mean±SD)

表3 各組大鼠肝的NO濃度及iNOS活性Table 3.NO concentrations and iNOSactivities of the rat livers(Mean±SD)

5 HE染色結(jié)果

NC組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，肝小葉肝細(xì)胞分界清晰，胞核圓，位于細(xì)胞中央，偶見雙核，胞質(zhì)豐富。MD組肝索排列紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞出現(xiàn)多灶小灶性壞死，表現(xiàn)為核固縮或破碎，與周圍細(xì)胞連接松散。二甲雙胍及聯(lián)合治療可以改善糖尿病引起的肝臟病理變化，見圖1。

6 各組大鼠肝臟NO濃度和iNOS活性變化

32周齡時，MD組肝臟的NO濃度和iNOS活性較NC組明顯增加(P＜0.01)，與MET組相比，聯(lián)合治療在降低NO濃度(P＜0.01)和iNOS活性(P＜0.05)方面作用較強，見表3。

Figure 1.HE staining of the rat livers(×100).A:normal control group;B:model group;C:metformin treatment group;D:tetramethylpyrazine+aminoguanidine treatment group.圖1 各組肝臟組織HE染色

7 各組肝組織Western blotting結(jié)果

iNOS在NC組肝臟組織中表達(dá)較少，在MD組中表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，二甲雙胍和聯(lián)合治療均可降低iNOS的表達(dá)，且以TMP+AG組降低更為顯著(P ＜0.01)，見圖2。

Bcl-2在MD組表達(dá)較NC組明顯下降(P＜0.01)，MET組和TMP+AG組Bcl-2表達(dá)增加(P＜0.01)，干預(yù)組之間無顯著差異，見圖2。

Figure 2.The expression of Bcl-2 and iNOSin the rat livers.βactin served as internal control.NC:normal control group;MD:model group;MET:metformin treatment group;TMP+AG:tetramethylpyrazine+aminoguanidine treatment group.Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs normal control group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group;##P＜0.01 vs metformin treatment group.圖2 各組肝組織Bcl-2和iNOS的表達(dá)結(jié)果

Caspase-3在NC組肝臟組織中表達(dá)較少，在MD組中表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，二甲雙胍和聯(lián)合治療均可降低caspase-3的表達(dá)，且以TMP+AG組降低更為顯著(P＜0.01)，見圖3。

Fas在 MD組表達(dá)較 NC組明顯升高(P＜0.01)，聯(lián)合治療可顯著降低Fas表達(dá)(P＜0.01)，而二甲雙胍治療對Fas表達(dá)無明顯作用，見圖3。

Figure 3.The expression of activated caspase-3 and Fas in the rat livers.β-actin served as internal control.NC:normal control group;MD:model group;MET:metformin treatment group;TMP+AG:tetramethylpyrazine+aminoguanidine treatment group.Mean±SD. ＊＊P＜0.01 vs normal control group;▲P＜ 0.05，▲▲P＜0.01 vs model group;##P＜0.01 vs metformin treatment group.圖3 各組肝組織活化型caspase-3和Fas的表達(dá)結(jié)果

討 論

本實驗研究結(jié)果顯示，n0-STZ糖尿病大鼠肝損傷的標(biāo)志物ALT和AST升高，肝臟病理學(xué)發(fā)生改變。與此相對應(yīng)，肝臟iNOS表達(dá)水平升高、活性增強且NO水平升高，凋亡相關(guān)蛋白Fas和caspase-3表達(dá)水平升高，抑制凋亡的蛋白Bcl-2表達(dá)下降。川芎嗪與氨基胍聯(lián)合治療可以降低血清ALT和AST水平，減輕糖尿病所致肝損傷，結(jié)合本實驗結(jié)果及參考文獻(xiàn)，主要機制可能涉及以下三方面:

(1)聯(lián)合治療可以降低血糖水平。高血糖通過促進(jìn)活性氧簇和AGES生成，促進(jìn)肝細(xì)胞損傷的發(fā)生。血糖升高的主要原因是胰島素抵抗和/或胰島β細(xì)胞功能受損。氨基胍通過特異性抑制iNOS活性、iNOS表達(dá)及AGEs形成而改善胰島 β細(xì)胞功能［5-6］。川芎嗪本身具有降血糖作用［7］，與氨基胍聯(lián)合治療可以發(fā)揮協(xié)同作用，通過增加胰島β細(xì)胞免疫陽性染色的面積及細(xì)胞數(shù)量而發(fā)揮對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用［8］。本實驗研究結(jié)果亦表明，聯(lián)合治療可以降低胰島素抵抗指數(shù)，從而增強外周組織的胰島素敏感性而發(fā)揮降血糖作用。

(2)聯(lián)合治療可以特異性抑制肝臟iNOS活性，抑制iNOS蛋白表達(dá)，減少NO生成而發(fā)揮對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。作為一種自由基，iNOS源性NO可以與活性氧類中間產(chǎn)物反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽陰離子等活性氮和(或)活性氧類物質(zhì)。在機體抗氧化能力減弱的情況下，NO可直接或通過這些活性產(chǎn)物與蛋白、核酸等大分子起反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞功能，造成組織、細(xì)胞損傷［9-10］。氨基胍屬于精氨酸類似物，能選擇性地抑制iNOS活性，另外，氨基胍可通過降低核因子-κB p65及iNOS表達(dá)，緩解硝酸鹽應(yīng)激而對糖尿病肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用［11］。川芎嗪在小膠質(zhì)細(xì)胞N9細(xì)胞中通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶及蛋白激酶B磷酸化，抑制核因子-κB從胞漿向胞核轉(zhuǎn)位而抑制脂多糖誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)和NO生成［12］。在肝細(xì)胞中是否以類似機制抑制iNOS表達(dá)和NO生成還有待深入研究。

(3)聯(lián)合治療可以增加肝臟抗凋亡蛋白的表達(dá)、降低促凋亡蛋白表達(dá)，從而緩解肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮對肝組織的保護(hù)作用。介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑主要有死亡受體通路、線粒體通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等。Caspase是諸多調(diào)控通路的關(guān)鍵，而caspase-3又處于caspase級聯(lián)反應(yīng)的中心地位，caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡的早期事件和特異性分子標(biāo)記之一。Fas蛋白屬于腫瘤壞死因子受體家族成員，通過Fas配體-Fas-Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白-caspase-8-caspase-3效應(yīng)分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用。線粒體通路主要由Bcl-2家族成員介導(dǎo)。Bcl-2可抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔的開放，減少細(xì)胞色素C及凋亡因子的釋放，促使氫離子從線粒體中泵出，并提高線粒體的鈣緩沖能力而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的功能。聯(lián)合治療可以通過降低 Fas、活化型caspase-3表達(dá)、促進(jìn)Bcl-2表達(dá)而減少糖尿病所致肝細(xì)胞凋亡。

二甲雙胍是臨床上應(yīng)用廣泛的治療糖尿病的藥物。與二甲雙胍相比，聯(lián)合治療在降低糖尿病大鼠FINS、增強胰島素敏感指數(shù)、抑制iNOS活性、iNOS蛋白表達(dá)、降低Fas及活化型caspase-3表達(dá)等方面優(yōu)于二甲雙胍，為糖尿病發(fā)病機制的研究及尋找新的治療方案提供了新的選擇。