上調(diào)miR-187* 表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖活性的影響*

張麗靜， 劉 博， 趙增仁， 樊智彬， 田延鋒

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，河北 石家莊050031)

近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升。研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及凋亡過程中發(fā)揮重要作用［1］。本課題組早期利用miRNA 芯片篩查了結(jié)直腸癌組織和正常黏膜的miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-187* 是其中具有顯著差異性表達(dá)的miRNA 之一。為此，本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證miR-187* 的表達(dá)結(jié)果，并通過轉(zhuǎn)染模擬物，觀察上調(diào)miR-187* 表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)對象

人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2、DLD1、HCT116、HT29、LoVo、SW480、SW620 和SW1116 由香港中文大學(xué)消化疾病研究所于君教授饋贈。收集河北醫(yī)科大第一醫(yī)院2010 年6 月至2012 年6 月間正常結(jié)腸黏膜組織10 例。新鮮組織切除后快速置于液氮后儲存于-80 ℃冰箱。

2 主要試劑

McCoys 5A 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco;胎牛血清購自HyClone;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 購自Invitrogen;miRNA 提取試劑盒和miR-187* 熒光定量PCR 檢測試劑盒購自Ambion;miR-187* 模擬物和陰性對照購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司;MTS 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自Promega。

3 主要方法

3.1 miRNA 微陣列芯片檢測 選取3 例性別、年齡及臨床病理資料一致的結(jié)直腸癌患者，收集術(shù)中腫瘤組織及切緣正常黏膜組織標(biāo)本，提取RNA 后，采用ParafloTMmiRNA 微陣列芯片分析，篩選出結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)的miRNAs。miRNA 探針序列信息來自于Sanger miRBase Release 17.0 版本數(shù)據(jù)庫，該芯片含有1 719 條成熟的人miRNAs 探針，此項(xiàng)工作由美國LC Sciences 公司完成。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞株及正常結(jié)腸組織中miR-187* 表達(dá)水平的檢測 DLD1 細(xì)胞、SW480、SW620 和SW1116 細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基中，HT29 和HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)于McCoy's 5A 培養(yǎng)基中，LoVo 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中，均添加10%胎牛血清。6 孔板細(xì)胞培養(yǎng)板隔天傳代擴(kuò)增結(jié)腸癌細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)良好，近90%融合時(shí)，預(yù)冷PBS 沖洗細(xì)胞3 次終止培養(yǎng)，冰上刮棒刮取細(xì)胞移入離心管，離心后收集細(xì)胞備用。

取新鮮結(jié)腸組織100 mg，置于液氮預(yù)冷處理的研缽中，固化、研碎，備用提取RNA。按照miRNA 提取試劑盒說明，分別抽提8 株結(jié)腸癌細(xì)胞株及正常結(jié)腸新鮮組織中總miRNA。按照Ambion 公司的qRT-PCR miRNA 檢測試劑盒說明，首先對各個(gè)細(xì)胞系和新鮮組織總miRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用U6 作為內(nèi)參照。

3.3 miR-187* 模擬物的轉(zhuǎn)染 將結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 細(xì)胞接種后24 h，待貼壁細(xì)胞達(dá)到40% ～50% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染miR-187* 模擬物和陰性對照(negative control，NC)。

3.4 細(xì)胞增殖活性的檢測 (1)轉(zhuǎn)染miR-187* 模擬物組和NC 組結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞株，于轉(zhuǎn)染后24 h ，消化細(xì)胞，分別接種于96 孔板。按照MTS 細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明，分別于接種96 孔板后12、24、36、48 和60 h 各檢測1 次。每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，收集提取2 組細(xì)胞中RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，檢測增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)mRNA 的變化。PCNA 及GAPDH 引物由北京賽百盛生物公司合成。PCNA 上游引物5'-CTTTTCTGTCACCAAATTTGTACC-3'，下游引物5'-AACTGCATTTAGAGTCAAGACCC-3';GAPDH上游引物5'-AGCCTCAAGATCATCAGCAATG-3'，下游引物5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACG-3'。結(jié)果用2-ΔCt法計(jì)算，ΔCt =目的基因平均Ct 值-內(nèi)參照基因平均Ct 值。

3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染miR-187* 模擬物組和NC 組結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞株，于轉(zhuǎn)染后48 h，消化收集細(xì)胞樣品，制成單細(xì)胞懸液，然后1 200 r/min 離心5 min，棄上清液。用4 ℃預(yù)冷的70%冷乙醇固定，4 ℃保存，固定18 h。調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L，取1 mL 細(xì)胞懸液，用PBS 洗3 次，細(xì)胞重懸于1 mL PI 染液中，室溫避光孵育30 min 后，流式細(xì)胞儀測熒光強(qiáng)度，PI 染液終濃度為50 mg/L，RNase 終濃度為10 mg/L。CellQuest 分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期DNA 含量分析，確定細(xì)胞周期分布。

3.6 miR-187* 的靶基因預(yù)測及表達(dá)情況 檢索miRDB、DIANA-microT 和microRNA. org 等數(shù)據(jù)庫，取多個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因的交集，發(fā)現(xiàn)miR-187* 可能的靶基因有TBX22、B 細(xì)胞特異性莫洛尼小鼠白血病病毒整合位點(diǎn)1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1，BMI-1)、CDH2、MYB、RB1、FZD3 等。查閱相關(guān)文獻(xiàn)后，我們初步選定BMI-1 為可能的靶基因。隨后我們檢測了BMI-1 mRNA 在人結(jié)腸癌細(xì)胞株及正常結(jié)腸組織中的表達(dá)情況。BMI-1 上游引物為5'-GTGCTTTGTGGAGGGTACTTCAT-3 '，下 游 引 物 為 5 '-TTGGACATCACAAATAGGACAATACTT-3'，以GAPDH 作為內(nèi)參照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，收集細(xì)胞，Trizol 法提取細(xì)胞中的總RNA。采用熒光定量RT-PCR 方法檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中BMI-1 mRNA 的表達(dá)，結(jié)果用2-ΔCt法計(jì)算。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較用t 檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的差異采用單因素方差分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 結(jié)腸癌細(xì)胞株中miR-187* 的表達(dá)

本課題組前期使用miRNA 芯片檢測了3 對結(jié)直腸癌組織及匹配的遠(yuǎn)端正常黏膜組織中的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-187* 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)較正常結(jié)直腸黏膜組織明顯下調(diào)，見圖1。本實(shí)驗(yàn)中我們檢測了8 種結(jié)腸癌細(xì)胞株中miR-187* 的表達(dá)，如圖2 所示，在結(jié)腸癌細(xì)胞株中miR-187* 的表達(dá)較正常結(jié)直腸黏膜組織明顯下調(diào)，與組織芯片結(jié)果一致。

Figure 1. miRNA array results. T1，T2，T3:the primary tumor tissues from three cases of colorectal cancer patients;N1，N2，N3:the matched normal mucosal tissues.圖1 miRNA 芯片結(jié)果

Figure 2. miR-187* expression in eight colon cancer cell lines and the normal colon tissues. Mean ± SD. n = 3.＊＊P ＜0.01 vs colon cancer cell lines.圖2 結(jié)腸癌細(xì)胞株及正常結(jié)腸黏膜組織中miR-187* 的表達(dá)

2 miR-187* 對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 增殖活性的影響

將HCT116 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-187 模擬物和陰性對照，檢測miR-187* 的表達(dá)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-187* 模擬物組，miR-187* 的表達(dá)水平明顯升高，約是NC 組的1 000 倍，見圖3A。隨后使用MTS法檢測這2 組細(xì)胞在不同時(shí)點(diǎn)的增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-187* 模擬物組與NC 組相比，各個(gè)時(shí)點(diǎn)細(xì)胞的增殖活力顯著降低(P ＜0.01)，見圖3B。同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-187* 模擬物組，PCNA mRNA 的表達(dá)亦明顯降低(P ＜0.05)，見圖3C。

3 miR-187* 對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 細(xì)胞周期的影響

對轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，與NC對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-187 模擬物后，G2/M 期的細(xì)胞比例明顯增加，見圖4。

4 結(jié)腸癌細(xì)胞株中BMI-1 mRNA 的表達(dá)

采用熒光定量RT-PCR 檢測8 種結(jié)腸癌細(xì)胞株和正常結(jié)直腸黏膜組織中BMI-1 mRNA 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞株中BMI-1 mRNA 的表達(dá)較正常結(jié)直腸黏膜組織表達(dá)明顯增高，見圖5。

5 轉(zhuǎn)染miR-187* 抑制BMI-1 mRNA 表達(dá)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組及對照組HCT116 細(xì)胞中BMI-1 mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果表明，miR-187* 高表達(dá)導(dǎo)致BMI-1 mRNA 表達(dá)下調(diào)(P ＜0.01)，見圖6。

Figure 3. The effect of miR-187* on the proliferation of HCT116 cells.A:miR-187* expression after transfection with miR-187*mimics (n=3);B:MTS results(n=5);C:PCNA mRNA expression(n=3).Mean±SD. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs miR-187* mimics.圖3 miR-187* 對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 增殖活性的影響

Figure 4. Cell cycle of HCT116 cells tested by flow cytometry. Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs NC.圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

Figure 5. BMI-1 mRNA expression in human colon cancer cell lines and the normal mucosal tissues detected by realtime RT-PCR. Mean ± SD. n =3. * P ＜0. 05 vs normal.圖5 結(jié)腸癌細(xì)胞株中BMI-1 mRNA 的表達(dá)

討 論

miRNA 是一類長約19 ～24 nt 的單鏈非編碼RNA，它具有多種調(diào)控基因表達(dá)的功能。miRNA 主要通過特異性識別并結(jié)合靶mRNA 的3'-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，于轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)靶mRNA降解和(或)抑制翻譯過程而發(fā)揮作用［2］。miRNAs幾乎在所有細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡和應(yīng)激等。人類蛋白質(zhì)編碼基因約1/3 受miRNA 的調(diào)控［3］。

研究表明，miRNA 在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中存在許多異常表達(dá)的miRNA，功能研究也發(fā)現(xiàn)不同的miRNA 在結(jié)直腸癌的進(jìn)程中發(fā)揮著不同的作用:某些miRNA 通過靶向調(diào)節(jié)原癌基因起到抑制腫瘤的作用［4］，而某些miRNA 則通過靶向調(diào)節(jié)抑癌基因發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用［5］。例如:miR-143 通過直接抑制K-ras 癌基因的表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［6］;miR-195 通過調(diào)節(jié)Bcl-2 的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡［7］;miR-137 通過調(diào)節(jié)FMNL2 表達(dá)調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［8］。

為了探討miRNA 參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，本研究前期通過miRNA 芯片技術(shù)篩選出大量差異性表達(dá)的miRNA，其中miR-187* 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)。miR-187* (miR-187-5p)是miR-187 家族的一員，位于18 號染色體上［9］。目前關(guān)于miR-187 在腫瘤中的作用尚存在一定的爭議，有學(xué)者研究證實(shí)，卵巢癌中miR-187 呈高表達(dá)［10］，乳腺癌中miR-187 的高表達(dá)和患者的不良預(yù)后有關(guān)［11］，然而前列腺癌和胰腺癌細(xì)胞中miR-187 低表達(dá)［12-13］。

目前關(guān)于miR-187* 在腫瘤中的研究罕有報(bào)道。Liu 等［14］發(fā)現(xiàn)miR-187* 在胃癌患者中表達(dá)水平明顯升高，Ho 等［15］研究證實(shí)，毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中miR-187* 的表達(dá)水平明顯低于正常組織。然而未見在結(jié)直腸癌組織中的相關(guān)研究。為了驗(yàn)證前期芯片中miR-187* 表達(dá)的結(jié)果，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)再次檢測了8 種結(jié)腸癌細(xì)胞株中miR-187* 的 表 達(dá) 狀 況，結(jié) 果 發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞株中miR-187* 的表達(dá)較正常結(jié)腸組織顯著降低，與miRNA 芯片結(jié)果一致，表明miR-187* 的表達(dá)下調(diào)可能與結(jié)直腸癌發(fā)展有關(guān)。

為了深入了解miR-187* 在結(jié)腸癌發(fā)病過程中的具體作用及其對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究使用化學(xué)合成的miR-187* 模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞，上調(diào)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞中miR-187* 的表達(dá)，采用MTS 與流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期，測定細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)miR-187* 模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞后，明顯抑制該細(xì)胞增殖速度，抑制效應(yīng)持續(xù)48 h 以上;且轉(zhuǎn)染miR-187* 模擬物組PCNA mRNA 表達(dá)也明顯下降。miR-187* 模擬物轉(zhuǎn)染組中G2/M 期細(xì)胞明顯增多，提示轉(zhuǎn)染miR-187*模擬物后，可致HCT116 細(xì)胞周期發(fā)生改變。miR-187* 可能是通過將細(xì)胞周期阻滯在G2期，延長細(xì)胞增殖周期而起到抑制細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞增殖過程有諸多蛋白參與，推測miR-187*可能直接或間接錨定其中某些蛋白mRNA 3'-UTR區(qū)，使蛋白合成抑制或減少，使細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖活性失調(diào)而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。卵巢癌中的一項(xiàng)研究表明，miR-187 通過調(diào)控抑癌基因Dab2 促進(jìn)細(xì)胞增殖［10］。本課題組通過對多種miRNA 靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)BMI-1 可能是miR-187* 的下游靶點(diǎn)。BMI-1 是多梳家族成員之一，通過調(diào)控組蛋白乙?；蛉ヒ阴；揎椷^程，影響細(xì)胞增殖、凋亡過程［16-17］。研究證實(shí)，BMI-1 在多種腫瘤中高表達(dá)，包括胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等。蔣麗麗等［18］研究發(fā)現(xiàn)，BMI-1 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，抑制BMI-1 表達(dá)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及血管增生能力。本實(shí)驗(yàn)中，我們轉(zhuǎn)染miR-187* 模擬物之后，miR-187* 的表達(dá)明顯增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-187* 的高表達(dá)顯著抑制了BMI-1 的轉(zhuǎn)錄。因此我們推測miR-187* 可能通過調(diào)控BMI-1 而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-187* 高表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性，影響細(xì)胞周期，在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。BMI-1 可能為miR-187* 的作用靶點(diǎn)，深入探討二者的相互關(guān)系可為闡明miR-187* 的抑癌機(jī)制提供新的思路。

［1］ Ambros V. The function of animal microRNAs［J］. Nature，2004，431(7006):350-355.

［2］ Rosenfeld N，Aharonov R，Meiri E，et al. MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin［J］. Nat Biotechnol，2008，26(4):462-469.

［3］ Lim LP，Lau NC，Garrett-Engele P，et al. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs［J］. Nature，2005，433(7027):769-773.

［4］ Zhang N，Li X，Wu CW，et al. microRNA-7 is a novel inhibitor of YY1 contributing to colorectal tumorigenesis［J］. Oncogene，2013，32(42):5078-5088.

［5］ He X，Dong Y，Wu CW，et al. MicroRNA-218 inhibits cell cycle progression and promotes apoptosis in colon cancer by downregulating BMI1 polycomb ring finger oncogene［J］. Mol Med，2012，18:1491-1498.

［6］ Chen X，Guo X，Zhang H，et al. Role of miR-143 targeting KRAS in colorectal tumorigenesis［J］. Oncogene，2009，28(10):1385-1392.

［7］ Liu L，Chen L，Xu Y，et al. microRNA-195 promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity of human colorectal cancer cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2010，400(2):236-240.

［8］ Liang L，Li X，Zhang X，et al. MicroRNA-137，an HMGA1 target，suppresses colorectal cancer cell invasion and metastasis in mice by directly targeting FMNL2［J］. Gastroenterology，2013，144(3):624-635.e4.

［9］ Ferracin M，Pedriali M，Veronese A，et al. microRNA profiling for the identification of cancers with unknown primary tissue-of-origin［J］. J Pathol，2011，225(1):43-53.

［10］ Chao A，Lin CY，Lee YS，et al. Regulation of ovarian cancer progression by microRNA-187 through targeting Disabled homolog-2［J］. Oncogene，2012，31(6):764-775.

［11］Mulrane L，Madden SF，Brennan DJ，et al.miR-187 is an independent prognostic factor in breast cancer and confers increased invasive potential in vitro［J］.Clin Cancer Res，2012，18(24):6702-6713.

［12］Fuse M，Kojima S，Enokida H，et al. Tumor suppressive microRNAs (miR-222 and miR-31)regulate molecular pathways based on microRNA expression signature in prostate cancer［J］. J Hum Genet，2012，57(11):691-699.

［13］Schultz NA，Andersen KK，Roslind A，et al. Prognostic microRNAs in cancer tissue from patients operated for pancreatic cancer:five microRNAs in a prognostic index［J］.World J Surg，2012，36(11):2699-2707.

［14］Liu H，Zhu L，Liu B，et al. Genome-wide microRNA profiles identify miR-378 as a serum biomarker for early detection of gastric cancer［J］. Cancer Lett，2012，316(2):196-203.

［15］Ho CY，Bar E，Giannini C，et al. MicroRNA profiling in pediatric pilocytic astrocytoma reveals biologically relevant targets，including PBX3，NFIB，and METAP2［J］. Neuro Oncol，2013，15(1):69-82.

［16］崔學(xué)江，朱定軍，韓金利，等. siRNA 干擾Bmi-1 基因?qū)Π螂装〦J 細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制［J］. 中國病理生理雜志，2011，27(8):1519-1524.

［17］練國達(dá)，鄧 輝，陳茵婷，等.Bmi-1 基因過表達(dá)對人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1 增殖的影響［J］. 中國病理生理雜志，2012，28(5):807-810.

［18］蔣麗麗，楊昌山，趙燦國. Bmi-1 促人膠質(zhì)瘤SNB19 細(xì)胞生長惡化的作用機(jī)制［J］. 中國病理生理雜志，2013，29(3):418-424.