高燕 楊一兵 叢林海 湯勇 張帆
中耳膽脂瘤是耳科常見疾病,目前公認是機體防御慢性炎癥引起的一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)之一,主要表現(xiàn)為中耳腔內(nèi)有大量高度增生的角化鱗狀上皮以及對周圍骨質(zhì)的破壞,其中膽脂瘤上皮細胞的移行、高度增殖及骨質(zhì)破壞是該病的重要特征。近年來不少研究顯示[1,2]單核細胞趨化因子(monocyte chemotactic factor,MCP-1)和纖維連接蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)在炎性細胞的趨化激活及角質(zhì)形成細胞的遷徙中起著重要作用,但其與中耳膽脂瘤的相關(guān)性鮮見報道。本研究通過免疫組化MaxVisionTM法檢測MCP-1和FN 在中耳膽脂瘤上皮及正常耳后皮膚組織中的表達,結(jié)合病例組術(shù)前CT和術(shù)中所見聽小骨及周圍骨質(zhì)的破壞程度,探討它們在膽脂瘤侵襲及上皮遷徙過程中的作用。
1.1 臨床資料 中耳膽脂瘤上皮標本30例,為昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年8月~2012年8月手術(shù)、經(jīng)病理檢查證實為中耳膽脂瘤的石蠟標本,臨床診斷均為后天繼發(fā)性膽脂瘤,其中,男17例,女13例;年齡12~64歲,平均39.33±17.68歲;左耳12例,右耳18 例;病程1~60 年,平均16.00±15.82年。膽脂瘤患者耳后皮膚標本20例,為行乳突根治術(shù)中所取耳后正常皮膚標本,其中,男14例,女6例;年齡13~56歲,平均35.05±12.80歲;左耳12例,右耳8 例;病程2~40 年,平均16.00±10.46年。非膽脂瘤患者耳后皮膚標本16例,為耳廓外傷患者行清創(chuàng)縫合術(shù)或外傷性鼓膜穿孔患者行耳后徑路Ⅰ型鼓室成型術(shù)時所取耳后正常皮膚標本。
1.2 主要試劑 兔抗人MCP-1多克隆抗體與兔抗人Fibronectin多克隆抗體均購自武漢博士德公司,兩種抗體的滴度均為1:100。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒及DAB 顯色試劑盒購自福州邁新公司。
1.3 免疫組化染色方法 標本經(jīng)常規(guī)甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)切片,厚約4μm。采用免疫組化Max-VisionTM對實驗標本染色,嚴格按照MaxVisionTM試劑盒說明書操作,步驟如下:切片常規(guī)脫蠟和水化后,枸櫞酸溶液中高溫高壓修復(fù)抗原,經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min。依次加入一抗(多抗MCP-1和FN)4 ℃過夜,滴加MaxVisionTM試劑37℃孵育20min,DAB顯色后,復(fù)染、脫水、透明和封片,顯微鏡下觀察結(jié)果。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。
1.4 免疫組化結(jié)果判定
1.4.1 陽性標準:MCP-1和FN 陽性細胞主要在胞漿、胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著,部分在膽脂瘤組織的基質(zhì)中。組織分層:膽脂瘤上皮和正常耳后皮膚上皮層分為基底層(basal layer)、棘層(spinous layer)、顆粒層(granular layer)和角質(zhì)層(straum corneum)[3]。膽脂瘤上皮的外周部分是膽脂瘤基質(zhì),由一層厚薄不一的纖維組織與鄰近的骨壁或組織相連[4]。
1.4.2 結(jié)果判斷標準
①人工計數(shù):在高倍鏡下(×400 倍),每張切片隨機選擇5個不重疊視野進行陽性細胞計數(shù),每個視野計數(shù)200個細胞,計算5個視野陽性細胞的平均百分數(shù)。根據(jù)顯色范圍分為陰性(-):陽性細胞<5%;弱陽性(+):陽性細胞占5%~25%;中度陽性(++):陽性細胞占26%~50%;強陽性(+++):陽性細胞>50%。
②灰度值測定:應(yīng)用高清晰彩色病理圖像免疫組化測量系統(tǒng)(HMIAS-2000)進行免疫組化圖像分析,經(jīng)標準灰度校正后,隨機每張切片取3個陽性視野,測定膽脂瘤組織中MCP-1及FN 的平均灰度值,灰度值隨陽性表達量的增多而減小。
③中耳膽脂瘤侵襲能力評定[5]:術(shù)前CT 及術(shù)中觀察膽脂瘤病變范圍及聽小骨破壞程度,按膽脂瘤上皮侵襲程度分成4組:①無明顯聽小骨破壞者為(+);②破壞砧骨者為(++);③破壞錘骨和砧骨者為(+++);④破壞乳突天蓋和/或乙狀竇骨板者為(++++)。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件對人工計數(shù)結(jié)果采用完全隨機設(shè)計四格表χ2檢驗;對灰度值檢測結(jié)果采用單樣本方差分析。膽脂瘤的侵襲能力與MCP-1 和FN 表達蛋白的灰度值采用Spearman等級相關(guān)分析;最后采用Pearson直線相關(guān)分析判斷MCP-1和FN 蛋白在膽脂瘤中的表達是否有相關(guān)性。
2.1 MCP-1和FN 在中耳膽脂瘤、非膽脂瘤患者耳后正常皮膚及膽脂瘤患者耳后正常皮膚中的表達 非膽脂瘤患者耳后正常皮膚和膽脂瘤患者耳后正常皮膚中MCP-1陽性表達呈弱陽性,為淡黃色顆粒,陽性表達率分別為37.5%和35.0%(圖1、2),兩者陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。中耳膽脂瘤上皮中MCP-1陽性表達位于上皮全層,以棘層表達密度較高,顆粒較粗,表達呈強陽性,為深棕色顆粒,陽性率為70%(圖3),與兩組耳后正常皮膚比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。非膽脂瘤患者耳后正常皮膚和膽脂瘤患者耳后正常皮膚上皮層中,F(xiàn)N 陽性表達率分別為31.3%和30.0%(圖4、5),兩者陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。中耳膽脂瘤上皮中FN 陽性表達位于上皮全層(基底層、棘層、顆粒層細胞及基質(zhì)),表達密度較高,顆粒較粗,表達呈強陽性,為深棕色顆粒,陽性率為76.7%(圖6),與兩組耳后正常皮膚相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。
2.2 中耳膽脂瘤上皮中MCP-1和FN 陽性表達的灰度值與中耳膽脂瘤侵襲能力的關(guān)系 MCP-1和FN 在三種組織類型中陽性表達的灰度值比較見表1,MCP-1或FN 在膽脂瘤上皮組中的表達灰度值低于膽脂瘤患者和非膽脂瘤患者耳后正常皮膚組中的表達灰度值,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而膽脂瘤患者和非膽脂瘤患者耳后正常皮膚中MCP-1或FN 的表達灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。采用Spearman 等級相關(guān)分析顯示膽脂瘤侵襲能力與MCP-1陽性表達灰度值有相關(guān)性(rmcp-1=-0.682,P<0.01),與FN 表達亦有相關(guān)性(rfn=-0.531,P<0.01)。
2.3 中耳膽脂瘤上皮中MCP-1和FN 表達的相關(guān)性 采用Pearson直線相關(guān)分析,MCP-1和FN之間無線性相關(guān)關(guān)系(tr=0.332,P>0.05)。
圖1 MCP-1在非膽脂瘤患者正常耳后皮膚中表達呈弱陽性(+)(免疫組化×400)圖2 MCP-1在膽脂瘤患者正常耳后皮膚中表達呈弱陽性(+)(免疫組化×400)圖3 MCP-1在膽脂瘤上皮中表達呈強陽性(+++)(免疫組化×400)圖4 FN 在非膽脂瘤患者正常耳后皮膚中表達呈弱陽性(+)(免疫組化×400)圖5 FN 在膽脂瘤患者正常耳后皮膚中表達呈弱陽性(+)(免疫組化×400)圖6 FN 在膽脂瘤上皮中表達呈強陽性(+++)(免疫組化×400)
表1 不同組織中MCP-1和FN 表達灰度值的比較(±s)
表1 不同組織中MCP-1和FN 表達灰度值的比較(±s)
組織類型例數(shù)MCP-1 平均灰度值 F P FN 平均灰度值 F P 30 147.2±20.1 139.2±18.5膽脂瘤患者耳后正常皮膚20 200.8±18.4 60.5<0.001 195.0±12.9 95.8<0.001非膽脂瘤患者耳后正常皮膚膽脂瘤上皮16 193.3±15.5 191.6±13.5
膽脂瘤雖然不是真正的腫瘤,卻有著類似腫瘤的生物學(xué)特性,具有進行性生長及侵襲破壞局部骨組織的能力,其危害主要取決于周圍骨質(zhì)的破壞程度,如果能夠明確其破壞骨質(zhì)的機制,將對膽脂瘤的治療有重要意義。慢性中耳炎在膽脂瘤的發(fā)病機制中有一定作用,其引起骨質(zhì)破壞與免疫反應(yīng)密切相關(guān)[6]。MCP-1對單核細胞、嗜堿性粒細胞、CD4+、CD8+、T 淋巴細胞及NK 細胞具有趨化激活雙重功能,使各種炎性細胞尤其是單核細胞向病變部位聚集,誘導(dǎo)這些細胞產(chǎn)生超氧陰離子和溶酶體酶,并產(chǎn)生IL-1、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子,而表皮生長因子(EGF)、脂多糖(LPS)、IL-1β、IL-4、TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)等又能夠誘導(dǎo)這些細胞產(chǎn)生MCP-1,形成惡性循環(huán),從而引起組織損傷。FN 能促進角質(zhì)形成細胞移動,還能促進單核巨噬細胞和成纖維細胞的遷徙,而單核巨噬細胞和成纖維細胞均能產(chǎn)生膠原酶,在骨質(zhì)破壞中起到重要的作用。
本研究結(jié)果顯示,MCP-1主要在中耳膽脂瘤上皮棘細胞層和顆粒層中表達,F(xiàn)N 主要在上皮基底層和基質(zhì)中表達,MCP-1和FN 在膽脂瘤上皮組織中異常增高,與膽脂瘤患者及非膽脂瘤患者耳后正常皮膚相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明膽脂瘤上皮具有趨化炎性細胞和高度遷徙能力。MCP-1和FN 在膽脂瘤患者和非膽脂瘤患者耳后皮膚之間的陽性表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),說明膽脂瘤上皮的趨化炎性細胞和高度遷徙能力只在膽脂瘤中體現(xiàn),而在其他部位與正常人無異,與Helgaland等[7]、Schilling等[8]和Chao等[9]的研究結(jié)果相似;膽脂瘤的侵襲能力與MCP-1和FN 陽性蛋白的灰度值之間呈負相關(guān)(P<0.01),而灰度值越低,陽性表達越高,說明膽脂瘤上皮的侵襲能力與MCP-1和FN 陽性表達呈正相關(guān),MCP-1和FN 表達越強,膽脂瘤上皮的侵襲能力越強,膽脂瘤上皮中MCP-1和FN 的表達水平可能可以作為評估膽脂瘤上皮侵襲能力的指標,但MCP-1和FN 陽性表達之間并不存在線性相關(guān)關(guān)系。
MCP-1和FN 在中耳膽脂瘤上皮和基質(zhì)中的異常表達可能在膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,炎性細胞浸潤、膽脂瘤上皮高遷徙能力可能參與了中耳膽脂瘤角化復(fù)層鱗狀上皮侵襲的機制。目前手術(shù)切除是治療中耳膽脂瘤唯一有效治療方法,但存在一定的復(fù)發(fā)率及并發(fā)癥,且術(shù)后部分患者的聽力無法恢復(fù),能否以MCP-1和FN 為靶點研究局部用藥,以延緩或阻止膽脂瘤上皮的侵襲能力,或者使膽脂瘤的角化復(fù)層鱗狀上皮轉(zhuǎn)變成非角化復(fù)層鱗狀上皮及其他類型的上皮,從而阻止膽脂瘤的生長,可能是將來研究的方向之一。
1 Hamill KJ,Hopkinson SB,Hoover P,et al.Fibronectin expression determines skin cell motile behavior[J].J Invest Dermatol,2012,132:448.
2 Voss A,Bode G,Kerkhoff C.Double-stranded RNA induces IL-8and MCP-1gene expression via TLR3in HaCaT-keratinocytes[J].Inflamm Allergy Drug Targets,2012,11:397.
3 Svane-Knudsen V,Rasmussen G,Ottosen PD.The distribution of free calcium ions in the cholesteatoma epithelium[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2005,262:77.
4 黃選兆,汪吉寶.實用耳鼻咽喉科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1998.851~857.
5 江超武,展鴻謀,王文惠,等.轉(zhuǎn)化生長因子β1和即刻早期基因及p27在中耳膽脂瘤上皮中表達[J].中華耳鼻咽喉科雜志,2004,39:211.
6 夏明,丁壽玲,張寒冰,等.破骨細胞分化因子及其相關(guān)因子在中耳膽脂瘤組織中的表達[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,21:315.
7 Helgaland T,Engelen B,Olsnes C.In vitro cholesteatoma growth and secretion of cytokines[J].Acta Oto-Laryngologica,2010,130:815.
8 Schilling V,Holly A,Bujia J.High levels of fibronectin in the stroma of aural cholesteatoma[J].American Journal of Otolaryngology,1995,16:232.
9 Chao WY,Yuan QG,Huang CC.Localization of fibronectin in human middle ear cholesteatoma[J].Arch Otorhinolaryngol,1988,245:160.