浦蘊(yùn)惠 , 許星鴻, 高 煥, 劉兆普 閻斌倫

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210095; 2.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、迎春蝦, 隸屬甲殼動(dòng)物亞門(mén)(Crustacea), 軟甲綱(Malacostraca), 真軟甲亞綱(Eumalacostraca), 十足目(Decapoda), 長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae), 為熱溫帶海區(qū)底棲蝦類(lèi), 是中國(guó)3種重要的經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)之一, 尤以黃海和渤海產(chǎn)量較多。脊尾白蝦肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富, 還可加工制成海米, 故有“金鉤蝦米”之稱(chēng), 其卵也可制成蝦籽, 是深受人們喜愛(ài)的海味佳肴。近年來(lái), 隨著中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊對(duì)蝦(Penaeus japonicus)等傳統(tǒng)蝦類(lèi)養(yǎng)殖難度的加大, 脊尾白蝦養(yǎng)殖面積迅速擴(kuò)大, 成為池塘單養(yǎng)及與其他種類(lèi)混養(yǎng)的重要品種。目前在脊尾白蝦的行為[1]、鹽度[2-3]、溫度[3]、營(yíng)養(yǎng)[4-6]、生長(zhǎng)[5-6]及育苗生產(chǎn)技術(shù)[7]等方面都已有研究, 但脊尾白蝦精子的體外保存迄今未見(jiàn)報(bào)道。在育種上, 精子的體外保存可避免近親交配, 增加遺傳優(yōu)勢(shì), 解決雌、雄不同步成熟等問(wèn)題, 對(duì)脊尾白蝦種質(zhì)優(yōu)選、雌核發(fā)育、建立優(yōu)良種質(zhì)庫(kù)有重要意義。作者采用精子存活率與頂體酶活力兩種評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的指標(biāo), 研究了脊尾白蝦精子體外保存中稀釋劑、抗凍劑對(duì)保存效果的影響, 試圖尋找脊尾白蝦精子體外保存的最佳條件, 以期為其精子代謝及生理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 脊尾白蝦來(lái)源及精子的采集

脊尾白蝦于2011年10月取自連云港贛榆縣養(yǎng)殖場(chǎng), 挑選雄性個(gè)體, 體長(zhǎng)(5.90±0.57)cm, 體質(zhì)量(2.76±0.78)g。解剖后, 取出精巢置于研缽中, 加入少量無(wú)鈣離子人工海水(海水配方: NaCl 21.63 g, NaOH 0.19 g, KCl 1.12 g, MgSO4·7H2O 4.93 g, H3BO30.53 g, 加蒸餾水定容至1 000 mL), 研磨后, 用200目篩絹網(wǎng)過(guò)濾去除組織碎片, 1 000 r/min離心5 min, 取得白色精子沉淀, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Ficoll液: 以 0.12 mol/L NaCl, 0.025 mol N-2羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(Hepes)緩沖液配制11%400型聚蔗糖(Ficoll)溶液, 調(diào)節(jié)pH 至7.5。加入0.1%疊氮鈉延長(zhǎng)Ficoll液的保存時(shí)間。

去污緩沖液: 以0.055 mol/L NaCl, 0.055 mol/L Hepes 緩沖液配制0.01%Triton X-100溶液, 調(diào)節(jié) pH為8.0, 加入0.1%疊氮鈉以延長(zhǎng)保存期。

500 mmol的鹽酸苯甲脒水溶液在冰箱中最長(zhǎng)可貯存2 周。

底物: 23 mmol/L Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-P-硝?；桨?BAPNA), 使用二甲基亞砜(DMSO)配制, 當(dāng)天使用。

底物和去污劑混合物: 去污劑緩沖液和BAPNA/DMSO底物按9: 1的體積混合。

稀釋劑成分:見(jiàn)表1。

表1 稀釋劑成分 Tab. 1 The composition of diluting solutions

1.3 方法

1.3.1 不同稀釋劑對(duì)精子低溫保存的影響

將1.1取得的白色精子沉淀置于離心管中, 分別用7種稀釋劑制備成106個(gè)/mL的精子懸浮液, 4℃下保存, 分別于0、1、2、3、4 d測(cè)定精子存活率及頂體酶活力。

1.3.2 不同稀釋劑對(duì)精子超低溫保存的影響

實(shí)驗(yàn)組設(shè)置與 1.3.1相同, 并每組添加10%DMSO作為抗凍劑, 對(duì)照組不加抗凍劑, 且以低溫保存下最佳稀釋劑為對(duì)照組的稀釋劑, 分別于0、1、2 d測(cè)定精子存活率以及頂體酶活力。

1.3.3 不同抗凍劑對(duì)精子超低溫保存的影響

采用上述所篩選出的最適稀釋劑, 以DMSO和甘油作為抗凍劑, 設(shè)置10個(gè)組合: 實(shí)驗(yàn)Ⅰ～Ⅳ組分別含甘油(V/ V) 5%、10%、15%、20%; 實(shí)驗(yàn)Ⅴ～Ⅷ組分別含二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO) (V / V) 5%、10%、15%、20%; 實(shí)驗(yàn)Ⅸ組分別含DMSO和甘油各10%; 實(shí)驗(yàn)Ⅹ組分別含DMSO和甘油各20%。

對(duì)照組不加抗凍劑, 各組精子與稀釋劑的混合液于冰箱4℃降溫平衡30 min后, 然后將樣品投入液氮中保存。

解凍方法: 打開(kāi)液氮罐, 取出樣品迅速放入40℃水浴中解凍, 用以檢測(cè)各組精子存活率和頂體酶活力。

1.3.4 精子存活率的檢測(cè)方法

分別從各實(shí)驗(yàn)組取1滴精子懸液于干凈載玻片上, 涂片, 用2%曙紅B染色液(天然海水配制)染色3～4 min, 顯微鏡觀(guān)察, 死精子染成紅色, 活精子不著色或者部分輕微著色。每次隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)精子, 分4個(gè)隨機(jī)計(jì)數(shù)點(diǎn), 每個(gè)點(diǎn)約計(jì)50個(gè)精子, 統(tǒng)計(jì)精子存活率。

1.3.5 精子頂體酶活力的測(cè)定方法

作者參考Kennedy[15]的方法, 并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

(1) 1.5 mL離心管中加入精子懸液, 每管體積不多于 250μL; (2) 同時(shí)做對(duì)照實(shí)驗(yàn), 0.5 m L Ficoll液注入1.5 mL離心管, 精液必須懸在Ficoll上; (3) 室溫條件下, 3 400 r/min離心30 min; (4)去除精漿和 Ficoll 懸浮液, 大約有100μL 的精子沉淀和少量 Ficoll留在管中; (5)加入100μL鹽酸苯甲脒溶液到對(duì)照組, 并攪勻; (6)每組試管(包括對(duì)照組)各添加 1 mL底物和去污劑混合液, 混勻; (7) 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化3 h, 每小時(shí)混合一下; (8)孵化3 h后, 添加100 μL鹽酸苯甲脒溶液到所有實(shí)驗(yàn)組(對(duì)照組除外); (9) 3 400 r/min離心30 min, 分別收集懸浮溶液; (10)用酶標(biāo)儀在410 nm處測(cè)量吸光值; (11)酶活力計(jì)算: 頂體酶的國(guó)際單位, 可以用在 25℃降解1μmol Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-P-硝?；桨?Nα-Benzoyl- DL-arginine-P-nitroanilide hydrochloride, BAPNA) /min來(lái)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示, 并采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理, 進(jìn)行單因子方差分析(One-way ANOVA), LSD(Least Significant Difference)多重比較、Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同稀釋劑對(duì)精子低溫保存的影響

脊尾白蝦精子在各稀釋劑中保存的時(shí)間均為4 d, 不同稀釋劑對(duì)低溫保存后精子存活率的影響見(jiàn)表2。精子初始存活率為93.18%, 隨著處理時(shí)間延長(zhǎng), 各組精子存活率與頂體酶活力均出現(xiàn)差異。4℃下保存30 min后, 除稀釋劑Ⅱ、稀釋劑Ⅶ外, 其余稀釋劑的精子存活率均在85%以上, 其中稀釋劑Ⅰ的存活率最高, 達(dá)到89.63%, 稀釋劑Ⅶ最低, 為76.86%, 1、2 d后各組存活率持續(xù)下降, 趨勢(shì)大體相同, 稀釋劑Ⅰ均為最高, 其次為稀釋劑Ⅴ、Ⅵ, 稀釋劑Ⅶ最低。4 d后稀釋劑Ⅰ下存活率最高, 達(dá)到71.50%。從降幅來(lái)看, 以稀釋劑Ⅰ最小, 其次為稀釋劑Ⅴ、Ⅵ, 稀釋劑Ⅶ降幅達(dá)到最大, 高達(dá)41.71%。

表2 不同稀釋劑對(duì)低溫保存的脊尾白蝦精子存活率的影響 Tab. 2 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under hypothermic preservation with different diluting solutions

圖1 不同稀釋劑對(duì)低溫保存的脊尾白蝦精子頂體酶活力的影響 Fig.1 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under hypothermic preservation with different diluting solutions

不同稀釋劑對(duì)低溫保存后精子頂體酶活力的影響見(jiàn)圖1, 隨著處理時(shí)間延長(zhǎng), 低溫保存后的精子頂體酶活力逐漸下降。4℃平衡30 min后, 稀釋劑Ⅰ保 存下的精子頂體活力最高, 其次為稀釋劑Ⅴ、 , Ⅵ 稀釋劑Ⅶ保存下的精子頂體酶活力最低。低溫保存4 d后, 稀釋劑Ⅰ保存下的活力最高, 為1.803 μIU/106, 對(duì)照組最低。

由表2、圖1比較分析得出, 兩種評(píng)價(jià)精子活力的方法得出的結(jié)果基本一致, 變化趨勢(shì)相同, 壬氏液為脊尾白蝦精子低溫保存的最佳稀釋劑, 其次是稀釋劑 , Ⅴ 稀釋劑Ⅶ的保存效果最差。4 d后, 各組稀釋劑精子存活率與頂體酶活力之間相關(guān)性顯著,γ=0.846 (P<0.05)。

2.2 稀釋劑對(duì)精子超低溫保存的影響

不同稀釋劑對(duì)精子超低溫保存后存活率的影響見(jiàn)表3。精子初始存活率為92.54%, 隨處理時(shí)間延長(zhǎng), 各組精子存活率出現(xiàn)差異。4℃平衡后, 除對(duì)照組外, 其余各組稀釋劑的精子存活率均在85%以上, 其中稀釋劑Ⅰ的存活率最高, 達(dá)到90.23%, 稀釋劑Ⅶ最低, 為86.53%, 1 d后各組存活率持續(xù)下降, 稀釋劑Ⅰ下的存活率仍為最高。2 d后, 稀釋劑Ⅰ下存活率最高, 達(dá)到83.50%, 對(duì)照組最低, 降至55.66%。從降幅來(lái)看, 以稀釋劑Ⅰ最小, 其次為稀釋劑Ⅵ、Ⅴ, 稀釋劑Ⅶ降幅達(dá)到最大, 達(dá)18.63%。各組的保存效果均比4℃下的保存效果好。

表3 不同稀釋劑對(duì)超低溫保存的脊尾白蝦精子存活率的影響 Tab. 3 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different diluting solutions

不同稀釋劑對(duì)精子超低溫保存頂體酶活力的影響見(jiàn)圖2, 隨著處理時(shí)間延長(zhǎng), 精子的頂體酶活力逐漸下降。4℃平衡30 min后, 稀釋劑Ⅰ保存下的精子頂體活力最高, 為3.760μIU/106, 其次為稀釋劑Ⅴ、Ⅵ, 除對(duì)照組外稀釋劑Ⅶ保存下的精子頂體酶活力最低。保存2 d后, 稀釋劑Ⅰ保存下的活力仍然最高, 為2.507μIU/106, 對(duì)照組最低, 僅為0.919μIU/106。

圖2 不同稀釋劑對(duì)超低溫保存的脊尾白蝦精子頂體酶活力的影響 Fig. 2 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different dilution solutions

由表3、圖2比較分析得出, 兩種評(píng)價(jià)精子活力的方法得出的結(jié)果相似, 壬氏液為脊尾白蝦精子超低溫保存的最佳稀釋劑, 稀釋劑Ⅶ的保存效果最差, 且此結(jié)果與4℃下低溫保存的結(jié)果相似。各組稀釋劑精子存活率與頂體酶活力之間相關(guān)性極顯著,γ=0.862 (P<0.01)。

2.3 抗凍劑對(duì)精子超低溫保存的影響

不同抗凍劑對(duì)精子超低溫保存后精子存活率的影響見(jiàn)表4。精子初始存活率為92.36%, 平衡后各組的存活率均有不同幅度的降低, 對(duì)照組下降最明顯。超低溫保存1 d后, 對(duì)照組存活率最低, 實(shí)驗(yàn)組Ⅶ的精子存活率最高, 達(dá)到85.11%, 其次為實(shí)驗(yàn)組Ⅵ、Ⅴ。保存2 d后, 精子存活率明顯下降, 但仍是實(shí)驗(yàn)組Ⅶ的存活率最高, 高達(dá)81.32%, 其次為實(shí)驗(yàn)組Ⅵ、Ⅴ, 對(duì)照組僅為42.84%。

從表4分析得出, 隨著甘油體積分?jǐn)?shù)的增加, 精子存活率也逐漸增加, 但達(dá)到20%時(shí), 存活率卻有所下降。同樣隨著DMSO的體積分?jǐn)?shù)從5%到15%, 存活率也隨之升高, 15%時(shí)達(dá)到最高, 而20%時(shí)存活率下降。10%甘油和10%DMSO的實(shí)驗(yàn)組Ⅹ的存活率較其他實(shí)驗(yàn)組都要低。

不同抗凍劑對(duì)超低溫保存后精子頂體酶活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。平衡30 min后, 各組精子頂體酶活力即出現(xiàn)了明顯差異, 實(shí)驗(yàn)組Ⅶ的頂體酶活力最高, 其次是實(shí)驗(yàn)組Ⅲ、Ⅵ。1 d后, 各組頂體酶活力均下降, 實(shí)驗(yàn)組Ⅶ的頂體酶活力在各實(shí)驗(yàn)組中仍然最高, 其次是實(shí)驗(yàn)組Ⅵ、Ⅴ, 對(duì)照組精子頂體酶活力最低。2 d后趨勢(shì)與1 d后相同, 實(shí)驗(yàn)組Ⅶ的頂體酶活力降為1.385μIU/106。

由表4、圖3比較分析得出, 兩種評(píng)價(jià)分析精子活力的方法得出結(jié)果大體相同, DMSO比甘油的保存效果好, 且實(shí)驗(yàn)組Ⅶ保存效果在所有實(shí)驗(yàn)組中最好, 其次是實(shí)驗(yàn)組Ⅵ, 對(duì)照組兩種指標(biāo)值均最低。各實(shí)驗(yàn)組精子存活率與頂體酶活力之間相關(guān)性極顯著, 相關(guān)系數(shù)γ=0.864(P<0.01)。

表4 不同抗凍劑對(duì)低溫保存的脊尾白蝦精子存活率的影響 Tab. 4 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different cryoprotectants

圖3 不同抗凍劑對(duì)超低溫保存的脊尾白蝦精子頂體酶活力的影響 Fig. 3 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different cryoprotectants

3 討論

3.1 精子保存質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法

觀(guān)察精子運(yùn)動(dòng)性是評(píng)價(jià)無(wú)脊椎動(dòng)物精子活力的方法。十足目甲殼動(dòng)物精子沒(méi)有鞭毛[16], 精子不能運(yùn)動(dòng), 所以運(yùn)動(dòng)能力不能用于其精子的評(píng)價(jià)。這是評(píng)價(jià)冷凍保存對(duì)脊尾白蝦精子活力影響的最大難點(diǎn)所在。已有的精子活力評(píng)價(jià)方法有生物染色、低滲外吐實(shí)驗(yàn)、精卵相互作用、生化分析及精子頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)[17-19]。

本實(shí)驗(yàn)采用染色法和頂體酶活力兩種方法來(lái)評(píng)價(jià)精子體外保存的效果。染色法要是依靠生物體的代謝作用, 將色素迅速排到胞外, 本實(shí)驗(yàn)采用2%曙紅B染色液, 死精子染成紅色, 活精子不著色或者部分輕微著色。精子頂體酶是精子頂體部特有的胰蛋白酶, 在頂體反應(yīng)、精子和卵子透明帶的結(jié)合及穿透中起重要作用。采用頂體酶活力作為指標(biāo)有利于甲殼動(dòng)物精子冷凍保存的研究。通常在此類(lèi)研究中較常用的是染色法, 本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法來(lái)評(píng)價(jià), 為驗(yàn)證頂體酶活力是評(píng)價(jià)精子活力有效方法提供依據(jù)。染色法的成本低, 但計(jì)數(shù)工作量大, 主觀(guān)性強(qiáng), 頂體酶活力的測(cè)定操作簡(jiǎn)便, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀(guān), 但成本較高。

3.2 稀釋劑對(duì)精子保存效果的影響

稀釋的天然或人工海水已被廣泛地用于十足目甲殼動(dòng)物精子冷凍的研究中[17,19-21]。本實(shí)驗(yàn)參考魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)、貝類(lèi)等精子稀釋方法, 根據(jù)脊尾白蝦生物學(xué)特性篩選出7種稀釋劑, 再根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的適宜pH和滲透壓修改而成。Na+、K+、Ca2+、Mg2+是精漿的重要組分, 也是構(gòu)成精漿滲透壓的主要離子。K+、Na+離子在無(wú)脊椎動(dòng)物精子活動(dòng)中具有重要作 用[22]。適量的K+有延長(zhǎng)精子壽命的作用。Ca2+對(duì)精子活動(dòng)的影響與K+、Na+和葡萄糖完全不同, Ca2+濃度過(guò)高會(huì)對(duì)精子活力產(chǎn)生抑制作用[23-24]。

陳東華等[25]研究發(fā)現(xiàn)稀釋劑Ⅴ是中華絨螯蟹精子短期體外保存的理想保存液。本實(shí)驗(yàn)中7種稀釋劑中保存效果以壬氏液(稀釋劑Ⅰ)的效果最佳, 其次為稀釋劑Ⅴ、稀釋劑Ⅵ, 這3組的稀釋劑中都含NaCl、KCl、NaHCO3這3種組分, 但各組含量不同, 可能導(dǎo)致保存效果的差異性。稀釋劑Ⅶ的保存效果最差, 可能是K+的濃度過(guò)高, 抑制了精子的活力。哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)精子保存的研究發(fā)現(xiàn), 適量添加葡萄糖等糖類(lèi)物質(zhì), 能有效維持低水平的精子代謝, 增強(qiáng)精子活力, 以延長(zhǎng)精子壽命[23-24]。但本實(shí)驗(yàn)中添加了葡萄糖的稀釋劑Ⅶ、D-20(稀釋劑Ⅲ)保存效果并不理想, 可能因?yàn)榧刮舶孜r為十足目甲殼動(dòng)物, 精子無(wú)鞭毛, 不能運(yùn)動(dòng), 對(duì)葡萄糖這類(lèi)能源物質(zhì)的需求不高, 所以添加了葡萄糖對(duì)保存效果并沒(méi)有幫助。D-20(稀釋劑Ⅲ)的保存效果差的原因可能還因?yàn)槌煞诌^(guò)于單一。

3.3 抗凍保護(hù)劑對(duì)精子保存效果的影響

Chow等[26]研究發(fā)現(xiàn)10%的甘油對(duì)羅氏沼蝦精莢的冷凍保存效果最佳, 解凍后能成功授精。陳松林等[27]用6%DMSO作為抗凍劑低溫保存鰱、鯉等鯉科魚(yú)類(lèi)的精子時(shí)效果最佳低溫保存?？聛喎虻萚20]采用含有10%DMSO和5%～10%甘油的稀釋液冷凍保存中國(guó)對(duì)蝦的精子, 存活率在60%以上, 解凍后人工授精, 受精率達(dá)到59%。不同甲殼動(dòng)物的抗凍劑是不一樣的, DMSO、甘油是最常用的兩種抗凍劑。甘油、DMSO通過(guò)滲入精子細(xì)胞中, 增加細(xì)胞質(zhì)的黏滯度和降低冰點(diǎn)等作用起到對(duì)精子的低溫保護(hù)。一方面, 隨著抗凍劑濃度的增加, 精子的保護(hù)作用加強(qiáng); 另一方面, 抗凍劑本身所具有的毒性又是其使用量的限制因子。章龍珍等[28]研究發(fā)現(xiàn)DMSO對(duì)淡水魚(yú)類(lèi)精子滲透壓有調(diào)節(jié)作用, DMSO能滲透到精子里面提高精子滲透壓, 精子滲透壓隨DMSO平衡時(shí)間和DMSO濃度增加而提高因提高滲透壓而降低冰點(diǎn)使精子在結(jié)冰前得以快速通過(guò)(0～60℃)危險(xiǎn)溫區(qū)[29]。陳松林等[30]研究也發(fā)現(xiàn)DMSO是通過(guò)滲入到細(xì)胞內(nèi)、提高胞內(nèi)滲透壓而起到抗凍保護(hù)作用。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也得出DMSO的保存效果優(yōu)于甘油。雖然甘油滲透力弱, 能降低原生質(zhì)冰點(diǎn)到-35℃左右。但與甘油相比, DMSO滲透力強(qiáng), 親水性好, 能與電解質(zhì)鰲合從而降低細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的濃度, 進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)保持水分, 使原生質(zhì)冰點(diǎn)降低到-40℃, 所以保存效果優(yōu)于甘油。且本實(shí)驗(yàn)中隨著DMSO、甘油體積分?jǐn)?shù)的增加, 保存效果也越來(lái)越好, 保存效果最佳的是15%DMSO, 但當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%, 保存效果下降。因?yàn)轶w積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定數(shù)值時(shí), 抗凍劑濃度過(guò)高, 抗凍劑產(chǎn)生了毒副作用, 因此在添加抗凍劑時(shí)應(yīng)當(dāng)注意濃度的選擇。

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